EBV对宿主免疫的调控作用研究进展

张旭娟 ， 赵鹏翔 ， 刘子怡 ， 蔡子松 ， 刘梦昱 ， 谢飞 ， 马雪梅

北京工业大学环境与生命学部，北京 100124

EBV又名人类γ疱疹病毒Ⅳ型（human gammaherpesvirus Ⅳ），在全球范围内的感染率超过90%［1］。EBV通过鼻咽部的体液交换感染粘膜上皮细胞并进一步感染B淋巴细胞，从而引起原发性感染；在与人体免疫系统的相互作用下，EBV在宿主细胞内建立稳定的潜伏性感染状态，并随宿主核基因的复制进行同步复制；机体免疫力低下、外界刺激等条件都可诱导EBV从潜伏感染转化为裂解感染状态，从而引发EBV的大量复制及病毒颗粒释放。成熟的EBV病毒颗粒呈球形，粒径约为180 nm，由DNA、衣壳蛋白和囊膜3部分组成。EBV基因组是一个全长为172 kb的双链线性DNA，编码80多个蛋白质和多种非编码RNA［2］。EBV基因组外侧是由162个壳微粒组成的20面立体对称的衣壳蛋白。病毒颗粒最外层为囊膜，在侵染宿主细胞的过程中发挥着重要作用。EBV被国际癌症研究机构认定为Ⅰ类致癌病毒，与伯基特淋巴瘤、鼻咽癌、胃癌等肿瘤的发生及发展和对宿主免疫系统的调控密切相关［3-4］，同时也与多种自身免疫性疾病有关，如红斑狼疮［5］。

与其他疱疹病毒一样，EBV通过调控病毒复制和宿主抗病毒免疫从而在受感染的个体中持续存在。在原发感染期间，EBV由先天性免疫识别并启动直接的抗病毒反应，随后协调适应性免疫共同发挥抗病毒作用。为了避免被宿主免疫监视清除，EBV采取一系列对策来应对宿主的抗病毒免疫反应，以维持病毒基因组在宿主内的稳定存在。本文就EBV在潜伏和裂解感染期表达的蛋白及非编码RNA对宿主免疫的调控作用进行综述，以期为病毒感染防治和病毒相关肿瘤的治疗提供基础理论依据及研究思路。

1 机体的抗病毒免疫

在生命的进化过程中，为了抵御病毒等病原体的侵害，除了皮肤和黏膜等防御屏障，机体也逐渐发展出了一系列抗病毒的免疫机制。机体在抵御病毒感染的过程中，首先会引发先天免疫，它能够识别病原体并在一定程度上控制病毒的感染［6］，然后引发适应性免疫，在树突状细胞、毒性T细胞、自然杀伤细胞以及B淋巴细胞等免疫细胞的参与下阻断感染并裂解病毒。在适应性免疫过程中，能够产生持续存在的特异性淋巴细胞，如记忆T细胞和B细胞等，从而在再次感染时提供快速免疫［7-8］。

先天性免疫通过模式识别受体来识别病毒等病原体的相关分子模式，其中跨膜模式识别受体TLRs能够识别病毒并诱导信号转导［9-10］。人类先天免疫效应细胞可以表达10种TLRs，不同TLR分子能够识别特定的病毒产物，其中TLR2能够识别疱疹病毒、人巨细胞病毒和麻疹病毒血凝素蛋白等，TLR3识别病毒的双链RNA，TLR4识别瘤病毒包膜等，TLR7/8识别病毒的单链RNA，TLR9识别病毒的双链DNA［11-12］。TLRs与配体结合后激活TLRs信号通路，主要通过细胞内的接头分子，如髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）、MyD88接头样蛋白Mal、Toll样受体相关的干扰素活化因子和Toll样受体相关的分子传递信号，进而活化炎症因子的转录因子——核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）和干扰素调节因子（interferon regulatory factors，IRFs）等，引起多种抗病毒细胞因子如干扰素（interferon，IFN）的释放［13-14］。

先天性免疫识别病毒后能够上调抗原提呈细胞表面的共刺激分子，启动适应性免疫，激活病毒特异性免疫细胞。在适应性免疫过程中，辅助性T细胞（CD4+T细胞）和杀伤性T细胞（CD8+T细胞）能够在细胞因子的参与下杀伤被感染的细胞，激活的B细胞分化为浆细胞后，分泌的中和抗体能够结合病毒防止感染的进一步扩散，最终在与吞噬细胞等免疫细胞与先天性免疫产生的细胞因子共同作用下清除病毒［9，15］。

除TLRs外，病毒双链/单链DNA或单链/双链RNA均可诱导干扰素刺激基因（interferon-stimulated genes，ISGs）的产生。在细胞内病毒被胞质模式识别受体（pattern recognition receptors，PRRs）识别，通过干扰素基因刺激因子（stimulator of interferon genes，STING）和线粒体抗病毒信号蛋白（mitochondrial antiviral signaling protein，MAVS）在内质网/线粒体相关膜上转换为转录因子活性。STING/MAVS的激活导致IRF3/7磷酸化，或IκB的磷酸化和泛素介导的降解。IRF3/7或NF-κB的磷酸化二聚体进入细胞核，与特异性启动子结合，激活IFN和ISGs的表达。这些ISGs不仅包括IFNs和PRRs，也包括如viperin的抗病毒效应物。IFN通过JAK-STAT通路诱导大量ISGs的表达，这些ISGs可分为抗病毒效应物和IFN信号转导的负/正调节因子［16］。

2 EBV对宿主的免疫调控

2.1 EBV的感染过程

如图1所示，初始感染时，EBV以非常低的效率通过唾液传播等途径感染口咽部的上皮细胞，并在细胞内进行裂解复制合成成熟的病毒颗粒。一部分病毒颗粒通过上皮细胞层的胞转作用感染初始B细胞，在EBV表面膜蛋白gp350/220与B细胞表面受体CD21［17］的相互作用下，EBV囊膜与细胞膜融合将EBV胞吞到细胞内，转运到细胞核附近后核衣壳与核膜融合，EBV线性基因组进入细胞核，在EBV基因组末端重复序列的介导下环化形成游离体并稳定存在于细胞核内，从而建立潜伏感染，诱导宿主B细胞分化为记忆细胞并随其细胞周期进行复制，此时EBV只有有限数量基因的表达用以维持其潜伏感染状态及宿主细胞的增殖［18-19］。

图1 EBV的感染过程Fig. 1 The process of EBV infection

当受到一定条件刺激时，如缺氧、DNA损伤等，记忆B细胞分化为效应细胞，诱导EBV由潜伏感染状态转变为裂解感染状态，在此过程中，EBV基因组大量复制形成线性EBV基因组串联体，并在TR处断裂形成单个基因组，而后被进一步包装形成具有侵染性的成熟病毒颗粒释放到细胞外［20］。成熟EBV颗粒能够在B淋巴细胞与上皮细胞之间穿梭完成感染周期，并可由鼻咽部上皮细胞经唾液等再次传播［21］。

EBV采取了在不同水平上调节这些信号通路的策略，以最小化宿主的抗病毒活性，从而维持持久性的感染。其中，EBV在潜伏感染以及裂解感染期均发展出了一系列逃逸宿主免疫策略以保证病毒基因组的延续，并在适当时机产生大量的成熟病毒颗粒以进一步扩大感染。

2.2 EBV在潜伏期的免疫调控

EBV能够通过一系列复杂的调控机制逃避宿主免疫以建立潜伏感染，潜伏期的EBV基因组呈高度甲基化［22］，病毒蛋白的表达被严格限制，从而能够逃避宿主的免疫监控，以稳定其潜伏状态并在体内长期存活［12］。潜伏感染时期基因表达产物有：①EBV编码的蛋白，包括潜伏膜蛋白LMP1/2（latent membrane proteins， LMPs）、核衣壳抗原EBNA1/2/3/LP（EBV nuclear antigens， EBNAs）；②EBV非编码RNA，包括小非聚腺苷酰化RNA EBER1/2（EBV encoded RNAs，EBERs）；③EBV编码的microRNA，包括miR-BHRF1、miR-BART及miRBART的前体BamHI-A右向读码区转录产物（BamHI-A rightwards transcripts， BART's）。不同类型EBV相关肿瘤细胞中存在不同的潜伏基因表达模式［23-24］，如表1所示，EBV在Burkitts淋巴瘤和胃癌细胞中为潜伏Ⅰ期，在鼻咽癌和NK/T淋巴瘤细胞中处于潜伏Ⅱ期，在类淋巴瘤母细胞（lymphoblastoid cell lines， LCLs，一类体外经EBV转化形成的永生化B淋巴细胞）为潜伏Ⅲ期。同时，不同表达模式的潜伏期也反映了初代B细胞从经历初次感染到生长转化的不同阶段，即在潜伏Ⅲ期的细胞中，EBNA1-6和LPM1/2蛋白表达；潜伏Ⅱ期期间，仅表达EBNA1和LMP1/2；潜伏Ⅰ期仅涉及EBNA1；而在潜伏0期，无任何EBV蛋白的表达［25］。

表1 EBV在4种潜伏类型中的基因表达和相关肿瘤Table 1 Gene expression and associated tumors of the four latent types in the latent state of EBV

在潜伏期虽然仅表达有限个数的EBV蛋白和非编码RNA，但却具有复杂的免疫调节功能（表2）。其中，LMP1的研究最深入，其能够模拟B细胞表面受体CD40信号，激活NF-κB、JNK、MAPK、JAK/STAT和PI3K信号通路来促进B细胞的生长和存活［45］及控制免疫应答，在EBV感染以及潜伏状态建立过程中发挥着重要作用［46］。LMP1共含有386个残基，包括1个含有24个残基的N端细胞质尾部结构域、6个跨膜结构域TM1-6（transmembrane domains 1-6）和1个含有200个残基的C端尾部结构域。其中，TM1-6能够不依赖于CD40激活IKK，进而激活经典和非经典NF-κB信号通路［26，47-48］，即RelA/p50二聚体和RelB/p52二聚体进入细胞核调节靶基因的转录导致Ⅰ型IFN的产生，同时能够降低TLR9的表达［29］，有益于感染细胞的生长。敲除LMP1 TM1-2可抑制LMP1介导的NF-κB活化，而敲除LMP1 TM3-6可降低约60%的LMP1介导的NF-κB活化［49］。除此之外，LMP1还能够介导IRF7的上调［28］以促进细胞存活，从而保证EBV能够在细胞内存在，同时诱导抑制性IRF7剪接变异体抑制Ⅰ型IFN产生的不利影响［50］。LMP1介导的JAK/STAT信号通路的活化能够进一步诱导干扰素刺激基因ISGs的抗病毒活性，以防止重复感染并促进EBV潜伏期的建立［27］。LMP2a似乎与LMP1功能相反，有研究发现癌细胞系中LMP2a表现为抑制NF-κB活性、IL-6产生以及JAK/STAT信号通路［30］；也有研究发现LMP2a在转基因小鼠B细胞中诱导NFκB激活，随后上调抗凋亡基因Bcl-2的表达以保护细胞免于凋亡［31］。此外，有研究发现，在上皮细胞中LMP2a和LMP2b都能加速IFN受体的转换，降低细胞对IFNα和IFNβ的反应性［32］，以避免EBV组分被强烈的宿主免疫清除。

1.1 一般资料 选取2017年1—3月（QCC实施前）中国人民解放军总医院14类重症监护病房MDRO感染的住院患者30例为对照组，另选2017年9—11月（QCC实施后）重症监护病房MDRO感染住院患者30例为观察组。

表2 EBV潜伏基因产物对宿主的免疫调节Table 2 Host immune regulation by EBV latent gene products

EBNA1几乎在所有潜伏期均有表达，它能够通过干扰19S蛋白酶体亚基的加工抑制自身蛋白酶体的降解和翻译［51］，以保证拥有足够的EBNA1水平来维持病毒基因组。此外，EBNA1还能通过干扰IKK的磷酸化过程抑制NF-κB途径逃逸宿主免疫［34］，通过调节NKG2D配体的表达降低NK细胞对EBV感染细胞的识别［35］。EBNA2则通过诱导低水平IFNβ致使B淋巴细胞系产生ISG［37］，同时抗增殖作用会被EBNA2对特定ISG的抑制中和［38］；增强IFNα产生后STAT3的转录活性以抑制炎性递质的产生［39-40］；诱导LMP1/2的表达能够加强对宿主免疫的调控促进潜伏［52-53］。

EBV编码2种EBERs和超过40种的microRNA，其中有一些被发现与免疫逃逸策略有关。在体外，EBERs能够与双链RNA依赖性的蛋白激酶R结合并抑制细胞凋亡［41］。EBV的microRNA被发现能够下调T细胞趋化因子CXCL-11（miRBHRF1-3），在体外增加NK细胞的杀伤能力（miRBART2-5p）；下调炎症小体传感器NLRP3（miRBART15）［43］，进而减少炎症因子IL-1β和IL-18的产生［39］；也能够通过下调IFNγ转录调节因子Tbet （BART20-5p）、IFNγ（BART20-5p）和STAT1（BART8）来调节EBV+NK细胞的IFNγ-STAT1通路［41，44］。

由此可知，在潜伏期，不论是EBV表达的蛋白质或非编码RNA，均通过调节宿主免疫过程在一定程度上促进潜伏期的建立，并逃避宿主免疫监视以维持EBV基因组在细胞内的稳定存在。

2.3 EBV在裂解期的免疫调控

EBV处于裂解感染状态时，基因表达具有严格的时间顺序性，依次表达立即早期基因（immediate-early genes，IE）、早期基因（early genes，E）和晚期基因（late genes，L）。IE基因为BZLF1和BRLF1，在宿主细胞转录因子结合到IE基因启动子后激活转录，表达产物分别为蛋白Z（Z、ZTA、ZEBRA）和蛋白R（R、RTA），Z和R作为反式激活因子与各自基因启动子结合增强转录，随后Z与R协同激活早期基因表达病毒复制相关蛋白。病毒基因组复制后，晚期基因随即表达与病毒包装相关的蛋白，如衣壳蛋白和囊膜蛋白等，包裹病毒基因组形成成熟的病毒颗粒，进而感染其他细胞。

在潜伏感染向裂解感染转变的过程中，为了避免宿主免疫对EBV产物的识别和清除，及产生完整的病毒颗粒，EBV主要靶向宿主TLRs以降低Ⅰ型IFN的产生，减少宿主的抗病毒活性。其中，EBV裂解期首先表达的BZLF1和BRLF1基因具有免疫调节作用，以保证裂解期的正常启动而不被免疫抑制［54］。BZLF1的表达被发现能够降低细胞内受体对TNFα和IFNγ的反应能力［55］；同时也能诱导细胞因子信号转导抑制因子SOCS3对JAK/STAT信号转导的抑制，促使IFN处于无反应状态［56］；此外，BZLF1引起TGFβ的表达，具有抗病毒活性的免疫抑制性细胞因子，并破坏炎症小体PML的形成；通过与IRF7相互作用来抑制IFNα和IFNβ的转录，从而降低IFNα和IFNβ的产生［57］；此外，有研究发现BZLF1蛋白与NF-κB存在相互抑制作用，高水平的NF-κB有利于EBV潜伏。而在裂解期，当BZLF1表达水平高于NF-κB的限制量时，虽不会影响NF-κB的核转位，却能够抑制其转录活性，导致下游细胞因子和炎症因子的产生水平降低，从而抑制宿主的抗病毒免疫反应［58-59］。与BZLF1类似，BRLF1作为立即早期基因能够通过减少IRF3/7的表达而抑制IFNβ产生，以减轻抗病毒反应［57］。EBV蛋白激酶BGLF4磷酸化后会抑制IRF3的转录活性［60］，降低IFNβ表达［61］的同时会抑制NF-κB的活性［62］。此外，EBV衣壳蛋白LF2靶向IRF7会抑制IFNα的产生［63］。与上述EBV基因功能类似，BPLF1能够干扰TLRs或LMP1介导的NF-kB活化［64］。但EBV dUTP酶却在免疫过程中发挥了与上述基因相反的效应，即依赖于TLR2/Myd88诱导NF-κB的激活［65］，抑制淋巴细胞增殖，从而诱导炎症因子的产生［66］。

可见，EBV裂解期基因与潜伏期各EBV潜伏基因对宿主免疫的调节策略有相同之处，如表3所示，它们都主要靶向TLRs信号通路，限制部分免疫效应以防止病毒基因组被宿主免疫作用监视并清除，同时又有部分基因能够促进NF-κB的激活和炎症因子的释放。似乎EBV可以一方面利用宿主免疫在激活作用中对自身有益的功能，如促进细胞存活，防止重复感染和促进EBV建立稳定的潜伏状态，另一方面抑制宿主抗病毒反应以保证EBV基因组的延续和成熟病毒颗粒的产生，使感染成为可能。由此可见，TLRs、IFN及其调节因子IRFs和NF-κB，尤其是NF-κB在EBV对宿主的免疫逃逸过程中占据了非常关键的作用，然而EBV对宿主免疫作用调节的复杂方式仍未被完全阐明，因此还需我们进一步研究EBV疱疹病毒甚至DNA双链病毒的免疫逃逸机制，为病毒感染的防治和病毒相关肿瘤的治疗提供基础研究理论依据。

表3 EBV裂解基因产物对宿主的免疫调节Table 3 Host immune regulation by EBV lytic gene products

尽管如此，至今仍没有证据表明EBV中BZLF1的核酸能够对包括NF-κB在内的宿主蛋白发挥调节作用，因此EBV BZLF1的核酸是否具有调控宿主的免疫作用还有待于进一步探究。

3 展望

EBV不同感染时期的蛋白或非编码RNA主要通过靶向宿主TLRs通路限制部分免疫效应，以防病毒基因组被宿主免疫作用监视清除，同时又能够通过促进炎症因子的释放促进细胞存活以达到维持EBV稳定的感染状态的目的。总之，通过综述EBV的免疫调控机制，发现这种病毒在其生命周期的潜伏和复制阶段采用了广泛的免疫调控策略，这些策略一方面通过对宿主免疫的激活以促进细胞存活，防止重复感染和促进EBV建立稳定的潜伏状态，另一方面抑制宿主抗病毒反应以保证EBV基因组的延续和成熟病毒颗粒的产生，并使感染成为可能。对于EBV免疫调控作用的深刻理解将有助于制定新的治疗策略来对抗EBV感染和相关疾病，特别是这种致癌性人类疱疹病毒引起的恶性肿瘤。目前，EBV甚至众多病毒对宿主的调控机制尚不完全明确，仅有部分病毒蛋白和非编码RNA的作用得以研究，其余病毒蛋白甚至mRNA对宿主免疫是否存在调控作用还需进一步研究。在临床使用免疫激动剂时，对于携带EBV的人群是否需要考虑免疫激活对EBV产生的影响，以及EBV的免疫调控作用是否能够被应用于免疫因子风暴的治疗等，都将是下一步需要解决的问题。未来，随着实验技术以及计算机预测方法的进一步发展，相信我们能够很快地全面揭露病毒在人类发展历史中的作用，甚至能够利用病毒对某些恶性肿瘤进行治疗。