互花米草黄酮提取物对肉鸡免疫功能的影响

孙秋艳，王彩霞，孙 霞，祈根兄，张兴娟，宋莎莎，袁东芳，李丛丛

（山东畜牧兽医职业学院/山东省畜禽抗菌药物使用减量化工程技术研究中心，山东 潍坊 261061）

互花米草作为保滩护岸、改良土壤、绿化海滩、改善海滩生态的植被[1]，由于其茎干密集粗壮、地下根茎发达，过度繁殖严重影响了海洋航运、沿海滩涂养殖，破坏了沿海湿地生态系统和生物多样性的维持[2-3]。人们一直在探索改善现状的经济有效的防控措施，但就目前的研究和实践来看，彻底防控的希望几乎渺茫，因此从合理开发利用资源这一角度探讨互花米草防治策略变得十分必要[4]。国内外研究发现，互花米草含有多种维生素和矿物质，尤其是黄酮类化合物含量较高，黄酮类化合物具有抗炎、降糖、降血脂、增强免疫等功效[5-6]。因此，将互花米草黄酮提取物高值化应用到现代畜牧业，将会带来生态和经济双重效益。目前，互花米草黄酮提取物对肉鸡免疫功能影响鲜有报道。为了探究互花米草黄酮提取物对肉鸡免疫效果的影响，本试验以AA 白羽肉鸡为实验动物，饲喂添加互花米草黄酮提取物的基础日粮，连续饲喂7 d，各组在7 d 点眼滴鼻、20 d 饮水免疫1 头羽份的ND La Sota+IB H120 二联活疫苗，通过检测血清中ND-Ab、IBAb、IgM、IgG、IgA、IFN-γ、IL-2、CD4+、CD8+含量和外周血中淋巴细胞转化率来评价免疫增强效果，为提高肉鸡健康水平和绿色养殖提供依据，为国家治理互花米草提供全新方案。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 疫苗 鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗（La Sota 株+H120 株）购自上海海利生物技术股份有限公司[批准文号：兽药生字（2010）090202038]。

1.1.2 主要试剂 鸡新城疫抗体（Newcastle disease antibody，ND-Ab）血凝抑制（Hemagglutination inhibition，HI）试验用抗原（生产批号：10132101）、阳性血清（生产批号：10152101）与阴性血清（生产批号：10142101）购自青岛立见诊断技术发展中心；鸡 IgM（生产批号：F4554-A）、IgG（生产批号：F4555-A）、IgA（生产批号：F4658-A）、鸡传染性支气管炎抗体（Infectious Bronchitis antibody，IB-Ab；生产批号：Trx4333-A）、IFN-γ（生产批号：F4564-A）、IL-2（生产批号：F4573-A）、T 淋巴细胞CD4 亚群（生产批号：F8182-A）、T 淋巴细胞CD8 亚群（生产批号：F8185-A）酶联免疫分析试验试剂盒购自上海泛柯实业有限公司。

1.1.3 互花米草黄酮提取物制备 新鲜互花米草9 月份采自昌邑市胶莱河入海口海道内，清洗干净，37 ℃烤箱烘烤，超微粉碎机粉碎晾干后采用醇提法提取黄酮。以芦丁为标准参照物，用NaNO2-Al（NO3）3法测定互花米草粗提物中黄酮的含量。提取的黄酮提取物高压灭菌，-20 ℃保存备用。

1.1.4 试验动物 120 只1 日龄AA 白羽肉鸡购自山东亚太中慧集团有限公司，随机分成4 组，每组30 只。I～III 组分别在基础日粮中添加互花米草黄酮提取物，添加剂量分别为 1、1.5、2 g/kg，IV 组为饲喂基础日粮对照组（CG），自1 d 开始，连续饲喂7 d。各组于7 d 点眼滴鼻、20 d 饮水免疫1 头羽份的新城疫、鸡传染性支气管炎二联活疫苗（ND La Sota+IB H120 株）。分别于7、14、21、28、35、42 d 从每组随机抽取5 只鸡，检测前禁食禁水6 h，进行相关指标检测。试验期间所用鸡均在山东畜牧兽医职业学院笼养鸡房严格按照笼养鸡饲养管理要求进行饲养。

1.2 方法

1.2.1 血清采集 无菌采集鸡3.0 mL 心脏血注入离心管中，22 ℃，4 000 r/min 离心25 min，取上清，-20 ℃保存备用。

1.2.2 血清中ND-Ab 效价的测定 采用中华人民共和国国家标准（GB/T 16550-2020）中的血凝抑制试验（HI）进行ND 抗体滴度的检测，记录结果为nlog2。

1.2.3 血清中IB-Ab 效价的测定 按照IB-Ab ELISA 试验盒操作步骤进行检测，450 nm 波长处测定OD 值，按照试剂盒结果判断标准判断阴阳性。

1.2.4 血清中IgM、IgG、IgA、IB-Ab、IFN-γ、IL-2、CD4+、CD8+含量的测定 均按照各试验盒操作步骤进行测定。

1.2.5 外周血淋巴细胞转化率的测定 EDTA-Na真空无菌采血管采鸡1 mL 心脏抗凝血，加入1 mL 的无血清RPMI-1640 稀释，轻轻摇匀，加入4 mL 人的淋巴细胞分离液（密度为1.085），20 ℃，2 000 r/min 离心20 min，将黄白色雾状淋巴细胞层吸出，加入到含有1 mL RPMI-1640 培养液中，20 ℃，2 000 r/min 离心20 min，弃上清，同上离心2 次，弃上清；沉淀细胞加入含10%胎牛血清的RPMI-1640 培养液悬浮，取一滴细胞悬液计数，将细胞悬液稀释至2×106个/mL；然后将淋巴细胞悬液接种至96 孔细胞培养板上，0.1 mL/孔，每个样品重复4 孔，其中3 孔加入终浓度为50 μg/mL 的刀豆蛋白（ConA），另1 孔做阴性对照，置37 ℃，体积分数为5%的CO2培养箱中待淋巴细胞长至单层取出；每孔加5 mg/L的MTT 溶液30 μL，继续培养4 h，轻轻将上清液弃去，每孔加 DMSO 溶液 200 μL，振荡10 min，用酶标仪检测490 nm 下的吸光度值，根据公式LTR=ODconA 刺激/OD 对照组×100%进行淋巴细胞转化率的计算。

1.2.6 数据分析 利用SPSS Statistics 19.0 统计分析软件进行数据分析，多重比较用LSD 法进行，试验数据用平均值±标准差（Mean±SD）并进行显著性比较。

2 结果

2.1 黄酮提取物的含量

按照方法中所述醇提法提取黄酮，以芦丁为标准参照物，用NaNO2-Al（NO3）3法测定所提取的黄酮提取物含量为37.2%。

2.2 血清中ND-Ab 效价的变化

各组血清中ND-Ab 效价变化见图1。结果显示，I～III 组血清中ND-Ab 效价显著高于IV 组（P＜0.05）；II 组血清中ND-Ab 效价显著高于IV组（P＜0.01），显著高于I 和III 组（P＜0.05）；III组血清中ND-Ab 效价显著高于I 组（P＜0.05）；各组血清中ND-Ab 效价均在鸡日龄28 d 达到高峰，随后逐渐下降。

图1 血清中ND-Ab 效价的变化

2.3 血清中IB-Ab 效价的变化

各组血清中IB-Ab 效价变化见表1。结果显示，所有组IB-Ab OD 值大于0.21，均为阳性。II 组血清中 IB-Ab 效价显著高于IV 组（P＜0.01），显著高于I 和III 组（P＜0.05）；II、III 组血清中IB-Ab 显著高于IV 组（P＜0.05）；III 组血清中IB-Ab 效价显著高于I 组（P＜0.05）；各组血清中IB-Ab 效价均在鸡日龄28 d 达到高峰。

表1 血清中IB-Ab 效价的变化（判断标准：阴性＜0.21，阳性＞0.21）

2.4 血清中IgM、IgG、IgA、CD4+、CD8+含量的变化

各组血清中IgM、IgG、IgA、CD4+、CD8+含量结果显示，I～III 组血清中 IgM、IgG、IgA、CD4+、CD+8 含量显著高于 IV 组（P＜0.05）；II 组血清中IgM、IgG、IgA、CD4+、CD8+含量显著高于IV 组（P＜0.05）；III 组血清中IgM、IgG、IgA、CD4+、CD8+含量显著高于I组（P＜0.05）；各组血清中 IgM、IgG、IgA、CD4+、CD8+含量在28 d 后达到高峰，见表2。

表2 血清中IgM、IgG、IgA、CD4+、CD8+含量的变化

2.5 外周血中IL-2、IFN-γ 含量的变化

各组外周血中IL-2、IFN-γ 含量的变化见表3。结果显示，II 组外周血中IL-2、IFN-γ 含量显著高于其他各组（P＜0.05）；IV 组外周血中IL-2、IFN-γ 含量显著低于其他各组（P＜0.05）；III组外周血中外周血中IL-2、IFN-γ 含量显著高于I组（P＜0.05）；所有组外周血中IL-2、IFN-γ 含量均在28 d 达到高峰，然后开始下降。

表3 外周血中IL-2、IFN-γ 含量的变化

2.6 外周血淋巴细胞转化率的变化

各组外周血淋巴细胞转化率的变化见表4。结果显示，II 组外周血淋巴细胞转化率显著高于其他各组（P＜0.05）；IV 组外周血淋巴细胞转化率显著低于其他各组（P＜0.05）；III 组外周血淋巴细胞转化率显著高于I 组（P＜0.05）；各组外周血淋巴细胞转化率在28 d 达到高峰。

表4 外周血淋巴细胞转化率的变化（%）

3 讨论与结论

机体血清抗体效价的变化能够准确、直观地反映体液免疫的状态[7]，日粮中添加互花米草黄酮提取物试验组的血清中ND-Ab、IB-Ab 效价显著高于空白对照组，可见日粮中添加互花米草黄酮提取物可提高机体的体液免疫水平。

血清免疫球蛋白在机体体液免疫中起到非常重要的作用[8]，IgG、IgM、IgA 代表血清中的免疫球蛋白的水平，含量越高说明机体体液免疫功能越强。禽类血清中IgG 含量远高于其它免疫球蛋白，且维持时间长，直接参与体液免疫反应，是机体抗感染免疫的主力；IgM 是初次体液免疫反应产生的重要免疫球蛋白，一般仅存在于血液内，起抗原受体作用；IgA 能凝集颗粒性抗原、中和病毒，是肠道、呼吸道、泌尿生殖道等黏膜抗感染免疫的主力。T 淋巴细胞CD4 亚群作为Th 细胞，可刺激B细胞的分化和抗体的生成，CD8 亚群为Tc 细胞，在Th 细胞的辅助下可杀死或溶解靶细胞，因此CD4+和CD8+含量反映T细胞活性，对免疫功能的判断有着重要作用。日粮中添加互花米草黄酮提取物的各组鸡血清中IgG、IgM、IgA、CD4+、CD8+含量显著高于空白对照组，可见日粮中添加互花米草黄酮提取物可提高鸡体体液免疫和细胞免疫水平。

IL-2 能刺激T 辅助细胞、自然杀伤细胞产生细胞因子，并促进细胞因子的繁殖以及刺激T 细胞在体外生长等功能，含量可间接反映机体的免疫水平[9]。IFN-γ 可促进辅助T 淋巴细胞（Th）分化生成Th1，抑制Th2 的生成，对机体进行免疫干预，实现免疫系统防御功能；可刺激自然杀伤细胞并增强其杀伤功能，有利于机体清除病毒感染；可直接促进细胞毒T 淋巴细胞成熟，刺激B 细胞分泌抗体，从而增强机体免疫功能，因此IFN-γ 含量可反映机体免疫水平[10]。日粮中添加互花米草黄酮提取物的各组外周血中IL-2、IFNγ 含量显著高于空白对照组，可见日粮中添加互花米草黄酮提取物可提高鸡体免疫水平。

血液淋巴细胞在机体的免疫应答中具有重要的作用，是反映细胞免疫的指标[11]。本研究发现，日粮中添加互花米草黄酮提取物的各组淋巴细胞转化率都显著高于空白对照组，可见日粮中添加互花米草黄酮提取物可以提高鸡体的细胞免疫水平。

在鸡生长日粮中添加互花米草黄酮提取物可显著提高鸡的免疫功能，本试验条件下，互花米草黄酮提取物添加剂量为1.5 g/kg 效果最佳。