甲基化酶DNMT3B、叉头框蛋白C1与宫颈癌超声特征的相关性分析

陈 然,肖 彬,管 鑫,乔金莹

(湖北省十堰市人民医院,湖北医药学院附属人民医院超声科,湖北 十堰 442000)

宫颈癌是低收入和中低收入国家妇女中最常见的癌症之一[1]。2020年超过50%的宫颈癌发生在生活在低收入和中等收入国家,对妇女健康造成严重损害[2-3]。尽管细胞学筛查无疑使宫颈癌负担大幅下降,但因其检测成本较高,导致该技术在基层医疗机构中的应用受限,近几年经阴道和直肠超声成为临床评估子宫颈癌局部扩散的可行方案,对后续的精准治疗至关重要[4]。近年来,通过基因组和蛋白质组学手段开发的分子标志物为疾病诊断和治疗带来了新的维度,DNA 甲基化已成为临床重点的表观遗传学研究方向, DNA甲基转移酶(DNA methyl transferase,DNMTs)是DNA 甲基化修饰的关键酶,DNA 甲基化修饰可以抑制恶性肿瘤的发生和发展过程中抑癌基因、促凋亡分子表达,同时可以促进癌细胞增殖,DNA甲基转移酶3B(DNA methyltransferase 3 beta,DNMT3B)可以催化DNA 从头甲基化过程,进而调控DNA 转录过程[5-6]。另外叉头框蛋白C1(forkhead box protein C1,FOXC1)是叉头框转录因子家族的成员,基因位于6p25染色体上,具有独特的DNA结合叉头结构域,FOXC1异常表达与细胞有丝分裂过程有关,进而对癌细胞增殖过程产生影响,敲除FOXC 1基因能通抑制癌细胞的体外增殖、迁移和侵袭[7]。DNMT3B、FOXC1在多种恶性肿瘤疾病中异常表达,但对宫颈癌的诊断价值鲜有报道。因此本次研究通过分析DNMT3B、FOXC1与宫颈癌超声特征的相关性,以期为临床提供更多的证据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2013年5月—2016年4月于我院经病理诊断为宫颈癌的患者117例(研究组)与同期健康体检女性50例(对照组)为对象。纳入标准:未接受任何特殊治疗,包括子宫切除术、放疗或化疗;拥有完整病历资料,排除标准:拥有其他恶性肿瘤史或放化疗史;先天性子宫畸形患者;凝血病患者;严重心、肝、肾功能障碍患者。 比较两组基线资料发现,2组受试者年龄、更年期比例差异无统计学意义(t/χ2值=1.787、0.627,P>0.05),具有可比性。

所有患者均已签署知情同意书。本研究已通过医院伦理委员会审核准许。

1.2彩色多普勒超声 选择配备DC5-8D超声探头的飞利浦彩色多普勒超声系统进行超声检测。检测前排空直肠和膀胱。检查时首先通过阴道超声检查子宫及双侧附属区域,确定宫颈病变区域的位置、数量、大小、形状、边界、回声及与周围组织的关系。其次,选择了彩色多普勒血流成像模式,观察宫颈区内部及周围的血流情况,计算并采集相关参数如血流、肿瘤大小等。

1.3Adler分级 根据检测到的血流进行Adler分级[8],0级:宫颈形态正常,无明显血流信号。Ⅰ级:1或2条直径为<1 mm的小血管,宫颈形态稍增厚。Ⅱ级:不均匀或增厚的宫颈回声分布,可检测到3～4条小血管。Ⅲ级:子宫旁和子宫外浸润和血转移,并检测到4条以上的血管,或者是交织成网络的血管。

1.4肿瘤标志物检测 抽取患者清晨空腹静脉血液5 mL,离心后取血清,由我院检验科采用电化学发光法检测血清糖类抗原125(carbohydrate antigen 125,CA125)、糖类抗原199(carbohydrate antigen 199,CA199)水平。

1.5蛋白质免疫印迹(Western blot,WB) 裂解液缓冲液(1×RIPA, cell Signaling Technology,USA)提血清中总蛋白,Bradford Assay(Bio-Rad,美国)测定蛋白浓度,将30 μg蛋白进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,然后转移到聚偏二氟乙烯膜(Millipore,美国)。用含0.1% Tween 20的5%脱脂牛奶在室温下封闭2 h后,用一抗在4 ℃下孵育过夜。DNMT3B与FOXC1的一抗(1∶1 000)来自Novus bioicals (Littleton,CO,美国,科罗拉多州)。在与辣根过氧化物酶结合的二抗(1∶5 000)孵育后,使用增强化学发光试剂(Thermo Pierce,USA)将蛋白显影,使用Quantity Ones 4.4.1(Bio-Rad Laboratories,Berkeley,CA)密度法测定靶蛋白条带水平。以β-actin为内参对照。

1.6统计学方法 应用SPSS 21.0统计软件处理数据。计量资料采用单因素方差分析、SNK-q检验、t检验。计数资料采用χ2检验。Spearman相关系数、Pearson相关系数分析相关性。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1宫颈癌患者彩色多普勒超声特征 我们采用Adler分级来描述宫颈癌患者的彩色多普勒超声特征,随着宫颈癌患者国际妇产科联盟(International Federation of Gynecology and Obstetrics,FIGO)临床分期的增加,宫颈癌患者的Adler分级也逐渐升高。50例对照组健康女性的Adler分级均为0级,宫颈癌FIGO临床分期Ⅲ～Ⅳ级患者的Adler分级均为Ⅲ级。见表1。

表1 宫颈癌患者彩色多普勒超声特征

2.2DNMT3B、FOXC1在宫颈癌中的表达 WB检测结果显示,研究组DNMT3B、FOXC1蛋白表达水平均高于对照组(P<0.05)。人工受试者曲线分析(ROC)结果显示,DNMT3B、FOXC1诊断宫颈癌的AUC分别为0.889、0.925。见图1,2,表2。

图1 DNMT3B、FOXC1在宫颈癌中的表达

图2 DNMT3B、FOXC1在宫颈癌中的蛋白表达图

2.3DNMT3B、FOXC1与彩色多普勒超声的相关性分析 随着Adler分级的增加,宫颈癌患者DNMT3B、FOXC1的表达水平也越来越高(P<0.05),表明宫颈癌中DNMT3B、FOXC1的表达水平与Adler分级呈正相关。见图3。

表2 DNMT3B、FOXC1鉴别诊断宫颈癌的ROC分析

图3 DNMT3B、FOXC1与彩色多普勒超声的相关性分析

2.4DNMT3B、FOXC1与CA125、CA199表达的相关性分析 CA125、CA199是两个与宫颈癌密切相关的肿瘤标志物,因此分析了DNMT3B、FOXC1与CA125、CA199表达的相关性,Pearson相关性分析结果显示,DNMT3B、FOXC1与CA125、CA199的表达均呈正相关。见图4。

2.5DNMT3B、FOXC1与宫颈癌患者临床特征的关系 将DNMT3B、FOXC1与117例宫颈癌患者的临床特征进行分类比较,结果显示,不同肿瘤大小、高危型HPV(-/+)、淋巴结是否发生转移、FIGO分期不同的患者癌中DNMT3B的表达水平差异有统计学意义(P<0.05),另外FOXC1在不同分化程度以及FIGO分期的患者癌中表达差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

图4 DNMT3B、FOXC1与CA125、CA199表达的相关性分析

表3 DNMT3B、FOXC1与宫颈癌患者临床特征的关系

3 讨 论

动态超声是目前妇产科诊断和治疗中应用最广泛、最成熟的影像学方法之一[9]。在本次研究选择了彩色多普勒超声中反映宫颈癌血流丰富程度的Adler分级,分析DNMT3B、FOXC1与宫颈癌超声特征的相关性,以期为不发达地区或基层医院提供更多的诊断宫颈癌的手段。

DNMT3B可能是宫颈癌治疗的新靶点。在Sun等[8]的研究结果中显示,就病毒易感性而言,DNMT3B可以影响病毒与宿主间的相互作用,维持病毒持续存在,促进细胞发生病理改变。本次研究结果显示,宫颈癌中DNMT3B、FOXC1的表达水平与Adler分级呈显著正相关。这提示,检测DNMT3B、FOXC1表达可以作为Adler分级的参考。由于肿瘤组织中血管的异常增生,宫颈癌细胞往往增殖、分裂迅速[10]。利用彩色多普勒超声可以检测肿瘤组织中各种类型的血流信号,反映肿瘤组织中的血管特殊结构和血流特征[11]。Adler分级主要集中在血流信号上,在一定程度上可以反映宫颈癌周围血管的增殖和微血管密度。既往的研究[12]已报道血液信号在一定程度上可以预测肿瘤的侵袭和转移能力。DNMT3B与FOXC1同样被报道与肝癌的侵袭与转移有关。Lai等[13]的研究结果显示DNMT3B通过调节IL-6/STAT3的表达促进肝癌细胞的下垂和抑制细胞的增殖。但是DNMT3B与宫颈癌的研究还鲜有报道,因此本研究可能将未来宫颈癌的诊治提供新得研究方向。而FOXC1则被miR-374c-5p调节参与宫颈癌的转移,并且FOXC1在有淋巴结转移的宫颈癌中表达上调[14]。我们也分析了DNMT3B与FOXC1宫颈癌患者临床特征的关系,结果显示DNMT3B与肿瘤大小、高危型HPV(-/+)、淋巴结是否发生转移、FIGO分期有关,FOXC1与肿瘤分化程度以及FIGO分期有关。但目前关于这方面的相关报道较少,这个结论还需要更多的数据验证。但总的来说,DNMT3B与FOXC1有望成为预测宫颈癌患者预后的可靠指标。

随着肿瘤标志物研究的不断深入,肿瘤相关标志物在癌症诊断和治疗中的作用日益重要[15]。有研究表明,宫颈癌与CA125和CA199标记物存在密切关系,也是宫颈癌的有效诊断标志物[16]。在本次研究中,CA125和CA199在宫颈癌中的表达均明显升高,并且与DNMT3B、FOXC1的表达存在明显正相关。本研究进一步分析了DNMT3B与FOXC1在宫颈癌中的诊断价值,ROC结果显示DNMT3B与FOXC1对宫颈癌均具有较好的诊断价值。

不过需要注意的是,本次研究的样本量不够大,临床分期相对粗糙,只进行了FIGO分期。其次本研究没有借鉴宫颈癌特异性标志物如鳞状细胞癌的肿瘤标志物,应在今后的研究中进一步阐明。而且Adler分级存在一定的主管因素,需要经验丰富的医师进行评价分级。

综上所述,宫颈癌中DNMT3B、FOXC1表达与宫颈癌动态超声结果有关,对宫颈癌的诊断有一定价值。