老鹳草素对大鼠心肌缺血再灌注损伤的作用及其机制

彭彩亮，崔 璇，蒋 宁，马熙凯，郭梦雨，王超龙，陈 曦，王首舜

（1.黑龙江中医药大学，哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学研究生院，哈尔滨 150040）

心血管疾病（cardiovascular diseases，CVD）仍然是全球死亡率最高的疾病之一。心肌缺血后血流再恢复可以缓解缺血症状，但可能会加重由心肌缺血/再灌注损伤（MI/RI）引起的心肌损伤。心肌缺血/再灌注损伤过程中的氧化应激、炎症反应等机制引起严重的心脏疾病如心脏功能障碍、心律失常，此外，还可引起心肌细胞坏死[1-2]。自噬是细胞对多种应激的保护机制之一，在心肌缺血/再灌注损伤过程中起重要作用，被认为是新的调控靶标[3-4]。Nrf2 信号通路可通过诱导细胞保护基因来保护细胞免受氧化应激。研究表明，Nrf2 信号通路与心肌缺血再灌注有关[5]。老鹳草素是老鹳草中的一种具有显著抗氧化活性的多酚化合物，具有抗高血压、抗氧化等作用[6-8]。本研究通过实施体内外实验，探讨老鹳草素对心肌缺血/再灌注损伤的保护作用及潜在机制。

1 材料和方法

1.1 实验材料 SPF 级雄性C57BL/6 小鼠75 只，8 周龄，体质量（24±2）g，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供。本研究通过动物伦理委员会批准（hljzy202001201）。H9C2 细胞购自中国科学院细胞库。老鹳草素购自美国Sigma 公司（20200816）；CK-Mb、Mb、cTnI 检测试剂盒，购自基蛋生物科技有限公司（20210205）；抗体β-actin、LC3II、LC3I、Beclin1、P62、Nrf2、 HO-1 均购自美国Cell Signaling Technology 公 司（20210318，20210219，20200115，20200402，20200317，20200425，20200502）。BCA 试剂盒购自碧云天生物技术公司（20210327）。 Gel Doc XR 型凝胶成像系统（美国Bio-Rad 公司）；BL-420F型生物信号采集系统（成都泰盟）；OlymPus CX31 正置显微镜（日本OlymPus 公司）； 2135 型组织切片机（德国徕卡公司）。

1.2 给药和建模 将75 只SPF 级雄性小鼠用随机数字表分为低剂量组（5 μmol/L）、中剂量组（10 μmol/L）、高剂量组（20 μmol/L）、假手术组和模型组，各15 只。根据文献方法[12]结扎左冠状动脉前降支制备心肌缺血/再灌注损伤模型（缺血30 min，再灌注2 h，以心电图 QRS 波加大和 ST 抬高作为建模成功的标准）和心肌缺血/再灌注损伤加不同剂量老鹳草素组 ，假手术组小鼠除不结扎外其他处理相同；老鹳草素处理组小鼠腹腔注射给药；假手术组和模型组给予等量生理盐水；每日1 次，连续7 d。末次给药后小鼠禁食、麻醉后连接心电图。气管造口完成后，连接呼吸机。结扎小鼠的左冠状动脉30 min，然后再灌注120 min。

1.3 心功能检测 再灌注2 h 后，超声心动图检查各组小鼠的左心室射血分数（LVEF）、左室短轴缩短率（FS）、左心室壁厚度（LVWT）、心率（HR）、左室收缩压（LVSP）水平。

1.4 检测心功能标志物 心功能监测结束后，各组各取10 只小鼠，取5 mL 股动脉血，3 000 r/min 离心15 min（离心半径12 cm），取上清液于-80 ℃储存，检测Mb、CK-Mb、cTnI 水平，采用ELISA 法严格按照试剂说明书操作，重复3 次。

1.5 苏木素-伊红（HE）染色观察心肌病理变化 心功能损伤标志物检测结束后，处死小鼠，将50 只小鼠开胸取出心脏，滤纸吸干水分和血迹，沿房室沟剪去左右心房、主动脉和肺动脉、右心室，留取左心室，从左心室中部横轴切下部分心肌组织（厚度约0.5 cm）于4%多聚甲醛中固定72 h。经脱水、透明、石蜡包埋、切片（厚度4 μm）后进行HE 染色，乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶片封片后置于显微镜下观察心肌病理变化。

1.6 细胞处理方法 H9C2 细胞购自中国科学院细胞库。按照标准细胞操作流程，用含10%胎牛血清的DMEM 培养液培养，即为对照组，模拟缺血/再灌注（SI/R）组的细胞用含有酚红的Hanks 液，置于低氧（1%O2）培养箱中培养3 h 后，更换成正常培养液，在普通培养箱中继续培养6 h。老鹳草素治疗（老鹳草素加 SI/R）组在模拟缺血/再灌注处理前30 min 用老鹳草素（终浓度为100 nmol/L[9]）处理细胞。自噬抑制剂3-MA 预处理组（3-MA 加老鹳草素加SI/R）在模拟缺血/再灌注处理前1 h 用3-MA（终浓度为5 µmol/L[10]）处理细胞。老鹳草素处理（Nrf2 SiRNA 加老鹳草素加 SI/R）组在模拟缺血/再灌注处理前48 h 用浓度为5 µmol/L 腺病毒SiRNA[11]转染细胞沉默Nrf2，模拟缺血/再灌注处理前30 min 用老鹳草素（终浓度为100 nmol/L）处理细胞。

1.7 Western blot 检测 从H9C2 细胞中提取总蛋白，BCA 蛋白定量试剂盒测量浓度。电泳分离蛋白，并转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。用5%脱脂乳封闭后，将聚偏二氟乙烯膜与下列抗体在4 ℃ 孵育过夜：兔抗P62（Abcam，中国；1:500）、兔抗LC3I（Abcam，中国；1:500）、兔抗 LC3II Beclin1（Abcam，中国；1:500）、兔抗Nrf2（Abcam，中国；1:500）、兔抗 HO-1（Abcam，中国；1:500）、β-actin 一抗（Abcam，中国；1:500），Tris 缓冲盐水冲洗后，将这些膜与HRP 标记过的IgG二抗（1:500）继续孵育1 h。ECL 试剂显示条带。

1.8 统计学方法 数据处理采用SPSS 22.0软件进行。计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。

2 结果

2.1 老鹳草素对各组小鼠左心功能的影响 见表1。

表1 各组小鼠心脏功能指标水平比较（± s，n = 10）

表1 各组小鼠心脏功能指标水平比较（± s，n = 10）

注：与假手术组比较，# P ＜0.05；与模型组比较，△P ＜0.05；与老鹳草素低剂量组比较，▲P ＜0.05；与老鹳草素中剂量组比较，□P ＜0.05

组别 HR/（beat/min） LVSP/（mm Hg） LVEF/% FS/% LVWT/min假手术组 406.42±31.89 133.24±13.61 59.11±6.58 27.62±4.12 0.90±0.05模型组 201.12±29.88# 59.01±12.15# 23.31±7.25# 8.12±2.52# 0.56±0.06#老鹳草素低剂量组 225.36±26.35△ 76.45±11.82△ 28.34±7.22△ 10.12±2.1△ 0.63±0.04△老鹳草素中剂量组 295.16±30.05▲ 98.12±11.72▲ 39.67±8.11▲ 16.54±3.0▲ 0.75±0.08▲老鹳草素高剂量组 305.16±21.25□ 112.34±8.92□ 43.56±9.61□ 19.54±2.6□ 0.82±0.03□

2.2 老鹳草素对各组小鼠血清CK-Mb、Mb、cTnI 的影响 见表2。

表2 各组小鼠CK-Mb、Mb、cTnI 含量比较（± s，n = 10）

表2 各组小鼠CK-Mb、Mb、cTnI 含量比较（± s，n = 10）

注：与假手术组比较，# P ＜0.05；与模型组比较，△P ＜0.05；与老鹳草素低剂量组比较，▲P ＜0.05；与老鹳草素中剂量组比较，□P ＜0.05

组别 CK-Mb/（U/L） Mb/（U/L） cTnI/（ng/L）假手术组 22.32±5.87 26.89±8.64 0.10±0.08模型组 106.89±9.78# 150.52±10.26# 0.82±0.05#老鹳草素低剂量组 86.43±7.65△ 132.34±8.23△ 0.52±0.02△老鹳草素中剂量组 70.53±8.72▲ 85.34±8.96▲ 0.32±0.06▲老鹳草素高剂量组 50.23±6.92□ 65.67±7.26□ 0.22±0.04□

2.3 老鹳草素对各组小鼠心肌病理变化的影响 光镜下可见，假手术组心肌结构整齐，心肌间质未见炎性细胞浸润，心肌细胞无肿胀。模型组小鼠心肌细胞肿胀，心肌结构紊乱，大量炎性细胞浸润心肌间质。老鹳草素低剂量组心肌结构部分整齐，炎性细胞浸润部分减轻，心肌细胞肿胀部分减轻。老鹳草素中剂量组心肌结构较整齐，炎性细胞浸润明显减轻，心肌细胞肿胀明显减轻。老鹳草素高剂量组心肌结构整齐，炎性细胞少许浸润，心肌细胞无肿胀。如图1。

2.4 老鹳草素对心肌缺血/再灌注损伤小鼠心肌组织中的自噬相关蛋白的影响 与假手术组相比，模型组LC3-II/LC3-I 比值、Beclin-1 升高，P62 水平降低（P＜0.05）；与模型组相比，老鹳草素低，中，高剂量组P62 水平升高，并呈现剂量依赖性升高。与模型组相比，老鹳草素低，中，高剂量组LC3-II/LC3-I 比值、Beclin-1 降低，并呈现剂量依赖性降低。见图2。

图2 老鹳草素对心肌缺血/再灌注损伤小鼠心肌组织中的自噬相关蛋白的影响

2.5 老鹳草素对心肌缺血/再灌注损伤小鼠心肌组织中的Nrf2 信号通路的影响 与假手术组比较，模型组Nrf2、 HO-1 蛋白水平降低（P＜0.05）；与模型组比较，老鹳草素低，中，高剂量组Nrf2、 HO-1 蛋白水平均升高（P＜0.05）。并呈现剂量依赖性升高。见图3。

图3 老鹳草素对心肌缺血/再灌注损伤小鼠心肌组织中的Nrf2信号通路的影响

2.6 老鹳草素对缺氧/复氧诱导损伤中H9C2 细胞的自噬相关蛋白的影响 与对照组比较，H9C2 细胞SI/R损伤后LC3-II/LC3-I比值、Beclin-1升高，P62降低（P＜0.05）；与SI/R 组比较，老鹳草素加 SI/R 组LC3-II/LC3-I 比值、Beclin-1 降低、P62 升高（P＜0.05）；与老鹳草素加SI/R 组比较，自噬抑制剂3-MA 预处理组LC3-II/LC3-I比值、Beclin-1降低，P62升高（P＜0.05）。见图4。

图4 老鹳草素对缺氧/复氧诱导损伤中H9C2 细胞的自噬相关蛋白的影响

2.7 老鹳草素对缺氧/复氧诱导损伤中H9C2 细胞的保护通过Nrf2 信号通路 与对照组比较，H9C2 细胞SI/R 损伤后Nrf2、 HO-1 蛋白水平降低（P＜0.05）；而与SI/R 组比较，老鹳草素加 SI/R 组Nrf2、 HO-1 蛋白水平升高（P＜0.05）；与老鹳草素加 SI/R 组比较，Nrf2 SiRNA 加老鹳草素加SI/R 组Nrf2、 HO-1 蛋白水平降低（P＜0.05）。见图5。

图5 老鹳草素对缺氧/复氧诱导损伤中H9C2 细胞的Nrf2信号通路的影响

3 讨论

介入治疗是快速恢复缺血性心脏病心肌缺血的重要治疗方式之一，但仍有可能发生心肌缺血/再灌注损伤[13]。Mb、CK-Mb、cTnI 是心肌损伤的标志物[14]。本实验结果显示， 心肌缺血/再灌注损伤小鼠的LVEF、FS、LVWT、HR、LVSP水平降低（P＜0.05），血清Mb、CK-Mb、cTnI 水平升高；心肌细胞肿胀，心肌间质大量炎性细胞浸润，而在心肌缺血/再灌注损伤建模之前予以不同浓度老鹳草素处理可以逐渐显著改善以上情况。本研究结果首次揭示老鹳草素对小鼠心肌缺血/再灌注损伤具有改善作用。

自噬是细胞自动降解自身受损的细胞器和蛋白质的过程[15]。在持续缺血缺氧或再灌注状态下，自噬表达过度增强，不利于细胞存活[16]。微管相关蛋白3（LC3）被认为是自噬标志分子[17]。Beclin-1 是自噬的正调节因子[18]。P62 蛋白与LC3 相互作用，其蛋白水平与自噬水平成反比[19-20]。本结果提示老鹳草素通过调控自噬抑制缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤。

研究报道Nrf2 信号通路参与自噬的调节[21]。机体在外界有害刺激下， 导致Nrf2 活化并进入细胞核，启动抗氧化蛋白的转录和表达[22]。HO-1 是Nrf2 信号通路中的关键靶蛋白[23]。本研究结果提示，老鹳草素通过Nrf2 信号通路减轻心肌缺血/再灌注损伤小鼠心肌损伤。

综上所述，老鹳草素可能通过激活Nrf2 信号通路，抑制心肌细胞过度自噬，对心肌缺血再灌注损伤起到明显保护作用，这是老鹳草素药理作用的新发现，为临床防治心肌缺血/再灌注损伤提供新的方法。