利用单片段代换系鉴定水稻抗性淀粉相关基因

罗嘉锐 ，竺正航，郝晴文，丁琳懿，朱海涛，张桂权，王少奎，杨维丰

(华南农业大学 农学院/广东省植物分子育种重点实验室/岭南现代农业科学与技术广东省实验室, 广东 广州 510642)

水稻是人类最重要的粮食作物之一，稻米的主要成分是淀粉，为人类提供了丰富的碳水化合物[1]。随着社会经济的发展和生活水平日益提升，高热量食物在饮食中的占比逐渐增大，从而导致高血糖、高血压和肥胖等慢性疾病的发病率越来越高；糖尿病现已成为威胁人类健康的重大疾病之一[2]。抗性淀粉是指不能在人的健康小肠中被消化和吸收的淀粉及其降解物，是一种有益于健康的膳食纤维[3]。抗性淀粉在大肠中可以经过肠道微生物群发酵产生大量对肠道健康有益的短链脂肪酸，以及改善肠道健康。抗性淀粉被认为是一种有益于预防和控制炎症性肠病、Ⅱ型糖尿病和肥胖等慢性疾病的功能性食品[4-6]。目前，大多数水稻品种的抗性淀粉含量(w)低于1%，只有极个别品种的抗性淀粉含量接近3%，籼稻品种的抗性淀粉含量高于粳稻[7-8]。因此，培育高抗性淀粉含量的功能性水稻新品种具有重要的现实意义。

抗性淀粉的形成与水稻胚乳淀粉的生物合成紧密相关，胚乳淀粉是由颗粒结合淀粉合酶、可溶性淀粉合酶、淀粉分支酶和淀粉去分支酶等淀粉合成相关酶协同合成的，抗性淀粉含量同样受到这类酶的调控[9-11]。这些淀粉合成相关酶的活性直接影响了胚乳直链淀粉和支链淀粉的含量以及淀粉分子链的结构特性，表现出不同胚乳淀粉的理化特性，进而影响了抗性淀粉的形成[11-13]。相关研究表明，直链淀粉比例较高的胚乳淀粉消化率低，抗性淀粉含量与直链淀粉含量呈正相关[14]。支链淀粉的链长也是影响抗性淀粉形成的重要因素，抗性淀粉含量与短支链比例呈显著负相关[15]，与中长支链比例呈正相关，这是因为中长支链在淀粉晶体结构中形成更稳定的螺旋(B-型淀粉晶体)，从而降低淀粉的消化率[15-17]。

SBEIIb基因位于水稻第2 号染色体上，编码淀粉分支酶IIb，SBEIIb在淀粉合成过程中支链淀粉簇内的短链形成中起关键作用。‘降糖稻1 号’是一个高抗性淀粉水稻突变系，‘降糖稻1 号’的SBEIIb的1 个SNP 引起第599 位的Leu 突变为Pro，导致SBEIIb 酶活性降低，结果促进了抗性淀粉含量的增加[10]。利用CRISPR/Cas9 基因编辑获得‘日本晴’和‘IR36’的SBEIIb突变体，其抗性淀粉含量较野生型增加了将近10 倍。SBEIIb突变体具有更高的直链淀粉含量及更多的支链淀粉长链，从而具有更高的抗性淀粉含量。SSIIa基因位于水稻第6 号染色体上，编码可溶性淀粉合成酶IIa，主要负责合成中等长度的支链淀粉分支，SSIIa第8 外显子内有3 个SNPs，引起氨基酸的改变，并导致了SSIIa 酶活性的变化，进而影响了淀粉的理化性质[13,18]。ISA1基因位于水稻第8 号染色体上，编码淀粉去分支酶，去除α-D-1,6 糖苷键，参与支链淀粉的合成，影响了直链淀粉和支链淀粉的比例[19-21]。Bao 等[7]通过对105 个水稻品种进行全基因组关联分析，鉴定出4 个水稻抗性淀粉含量候选基因Wx、SSIIa、ISA1和AGPS1，这些基因都是水稻胚乳淀粉生物合成相关基因。综上，SBEIIb、SSIIa和ISA1等水稻胚乳淀粉合成相关基因对抗性淀粉的影响十分显著，因此发掘这些基因中高抗性淀粉含量的等位基因对功能稻分子育种具有非常重要的意义。

染色体单片段代换系(Single segment substitution line, SSSL)是指在受体遗传背景中只代换供体的某一段染色体片段，其他遗传背景与受体亲本完全一致。SSSL 排除了遗传背景的干扰，是复杂性状基因定位、克隆以及挖掘有利等位基因的理想材料[22]。广东省植物分子育种重点实验室以‘华粳籼74(HJX74)’为受体，构建了43 个不同供体来源的2 360 份SSSLs，利用这些SSSLs 定位和克隆了很多与水稻产量和品质相关基因，并利用有利等位基因进行分子设计育种，定向改良水稻产量和品质[22]。本研究利用携带淀粉合成相关基因SBEIIb、SSIIa或ISA1的SSSLs，分析SBEIIb、SSIIa或ISA1基因的等位变异与抗性淀粉含量的关系，发掘高抗性淀粉含量等位基因，为高抗性淀粉含量的水稻新品种培育提供理论基础和基因资源。

1 材料与方法

1.1 试验材料与种植

受体亲本‘华粳籼74(HJX74)’是广东省植物分子育种重点实验室培育的华南地区高产籼稻品种；利用HJX74 与供体亲本多态性分子标记进行代换片段检测，从HJX74-SSSL 文库中筛选到20 份S S S L s 分别携带淀粉合成相关基因SBEIIb、SSIIa或ISA1，其代换片段来源于不同品种(表1)。所有试验材料于2021 年早季(2 月下旬至7 月上旬)和晚季(7 月中旬至11 月上旬)在华南农业大学科研农场(中国广州，北纬2 3°0 7′ 东经113°15′)种植。每个材料种植3 个重复小区，完全随机区组，每个小区2 行，每行10 株，株距为16.7 cm，单株插秧，根据广州地区的常规栽培管理措施进行田间栽培和病虫害防治。

表1 用于本研究的单片段代换系信息Table 1 The information of SSSLs used in this study

1.2 SSSLs 的代换片段检测和目标基因测序分析

秧苗移栽10 d 后，针对20 个SSSLs 以及受体亲本HJX74 和供体亲本，每种材料取5 个单株的幼叶，采用CTAB 法提取基因组DNA。以合格的DNA 样品作为模板，利用SSR 标记进行PCR 扩增，利用60 g/L 的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离PCR产物，银染显影后，以受体亲本HJX74 和供体亲本为对照，根据SSR 的带型来确定SSSLs的代换片段位置及长度。然后，根据目标基因的位置，筛选出分别携带SBEIIb、SSIIa或ISA1的SSSLs。

以‘日本晴’基因组序列为参考序列，利用引物设计软件Primer3Plus 对SBEIIb、SSIIa和ISA1基因序列分别设计特异扩增引物，然后利用PCR 扩增HJX74 和SSSLs 上的目标基因，将测序引物和HJX74 及SSSLs 目标基因的PCR 产物送至擎科生物公司进行测序，利用SeqMan 软件进行序列拼接和比对分析。

1.3 抗性淀粉含量的测定

利用改良的AOAC 法[9]测定水稻抗性淀粉含量，具体步骤如下：1)取0.01 g 干燥米粉与0.4 mL混合工作液(10 mg/mL 胰α-淀粉酶、3 U/mL 淀粉葡萄糖苷酶)充分混匀后，在37 ℃恒温震荡摇床中孵育12 h(200 r/min)；2)加入0.4 mL 无水乙醇充分混匀后离心10 min(13 000 r/min，4 ℃)；3)倒去上清液，加入0.8 mL 体积分数为 50%的乙醇溶液充分混匀后离心10 min(13 000 r/min，4 ℃)；4)重复步骤3) 1 次，倒尽上清液后烘干沉淀；5)加入钢珠和2 mol/L 的KOH 溶液0.2 mL 碾磨60 s，冷却10 min 后再次碾磨60 s；6)加入0.8 mL 醋酸钠缓冲液(1.2 mol/L，pH = 3.8)和0.01 mL 淀粉葡萄糖苷酶溶液(1 650 U/mL)，在50 ℃水浴中孵育30 min，每隔10 min 摇匀1 次；7) 离心10 min(13 000 r/min，4 ℃)，收集上清液；8)利用GOPOD 法测定上清液中的葡萄糖质量浓度，再用如下公式计算样品抗性淀粉含量(w)。

式中：葡萄糖质量浓度单位为μg/mL；1.03 为溶液体积，单位为mL；0.9 为淀粉的水解系数；10.0 为样品的质量，单位为mg；1 000 是将样品质量单位mg 转变为μg 的转换系数。

1.4 数据分析和作图

利用Microsoft Excel 2016 和SPSS 23.0 进行数据收集和统计分析；用MapChart、Origin 2018 、Microsoft PowerPiont 2016 和Adobe Illustrator 2018 进行绘图。采用Dunnett’st-test 比较分析每个SSSLs 抗性淀粉含量与对照HJX74 的差异显著性；采用Duncan’s 法多重比较分析携带同一基因座的不同SSSLs 间的抗性淀粉含量差异显著性。利用SMART 数据库(http://smart.embl-heidelberg.d e/) 预测蛋白的功能结构域，利用S W I S SMODEDL 数据库(https://swissmodel.expasy.org/)进行蛋白的三维同源性建模绘图。

2 结果与分析

2.1 携带SBEIIb、SSIIa 或ISA1 的SSSLs 鉴定及抗性淀粉含量分析

2021 年早季对筛选到的20 份分别携带了不同供体来源的SBEIIb、SSIIa或ISA1的SSSLs 的代换片段进行检测分析。其中：5 份SSSLs(04-02、07-02、12-02、15-02 和27-02)的代换片段位于第2 号染色体上，与SBEIIb基因座位重叠，这5 份SSSLs的代换片段长度分别为7.64、12.81、2.77、7.74 和5.17 Mb(图1)；7 份SSSLs(02-06、08-06、12-06、14-06、15-06、18-06 和21-06)的代换片段位于第6 号染色体上，与SSIIa基因座位重叠，这7 份SSSLs 的代换片段长度分别为2.92、12.05、3.03、2.73、4.22、6.82 和6.59 Mb(图1)；8 份SSSLs(04-08、05-08、07-08、08-08、09-08、11-08、13-08 和14-08)的代换片段位于第8 号染色体上，与ISA1基因座位重叠，这8 份SSSLs 的代换片段长度分别为3.28、3.86、5.63、4.54、3.53、4.66、4.97 和5.64 Mb(图1)。

图1 分别携带SBEIIb、SSIIa 和ISA1 的SSSLs 代换片段长度及在HJX74 染色体上的位置Fig. 1 The lengths of the target substituted segments of SSSLs carrying SBEIIb, SSIIa and ISA1, respectively, and their positions on the chromosomes of HJX74

在2021 年早季和晚季，分别对这20 份SSSLs和HJX74 进行抗性淀粉含量检测分析。HJX74 在早季和晚季的抗性淀粉含量分别为0.76% 和0.68%，20 份SSSLs 的抗性淀粉含量的差异很大，在早季和晚季的变异范围分别为0.61%～3.32%和0.67%～3.41%。其中，12 份SSSLs 的抗性淀粉含量与HJX74 一样低，没有显著差异；8 份SSSLs(04-02、12-02、15-02、08-06、21-06、08-08、09-08 和11-08)的抗性淀粉含量都极显著高于HJX74，在早季和晚季分别在1.02%～3.32% 和1.12%～3.41%(图2)。结果表明，这20 份SSSLs 的抗性淀粉含量存在丰富的变异，SBEIIb、SSIIa和ISA1基因影响稻米抗性淀粉的形成，不同供体来源的SBEIIb、SSIIa和ISA1对抗性淀粉含量的影响差异很大。

图2 分别携带SBEIIb、SSIIa 和ISA1 的SSSLs 的抗性淀粉含量Fig. 2 The resistant starch contents of the SSSLs carrying SBEIIb, SSIIa and ISA1, respectively

2.2 SBEIIb 的等位变异对抗性淀粉含量的影响

对HJX74 和位于第2 号染色体上的5 份SSSLs(04-02、07-02、12-02、15-02 和27-02) 的SBEIIb基因序列进行测序分析。结果发现，HJX74和这5 份SSSLs 在SBEIIb的编码区序列中存在4 个单核苷酸差异(SNPs)，可分为3 种单倍型。4 个SNPs 中，只有位于第4 外显子的第96 碱基由G 变为A，导致第196 位氨基酸由Arg 变为His。结合HJX74 和5 份SSSLs 的SBEIIb基因序列和表型变异连锁分析，可将这6 个材料的3 种单倍型分为2 种等位基因，分别为SBEIIb-1和SBEIIb-2。携带SBEIIb-1的04-02、12-02 和15-02 的抗性淀粉含量在1.63%～1.82%之间；携带SBEIIb-2的HJX74、07-02 和27-02 的抗性淀粉含量在0.72%～0.82%之间(表2、图3a)。结果表明，SBEIIb-1的抗性淀粉含量显著高于SBEIIb-2。SBEIIb 蛋白有3 个功能结构域CBM_48、Alpha-amylase 和Alpha-amylase_C，功能域CBM_48 具有水解酶活性功能，196-Arg/His 氨基酸变异位于功能域CBM_48 中，可能影响了SBEIIb 酶活性(图3b)。SBEIIb-1和SBEIIb-2编码的两个等位变异蛋白的三级结构没有差异(图3c)。

图3 SSSLs 中的SBEIIb 等位变异Fig. 3 The allelic variations of SBEIIb in SSSLs

表2 SSSLs 中的不同SBEIIb 等位基因的基因型和表型Table 2 Genotypes and phenotypes of different SBEIIb alleles in SSSLs

2.3 SSIIa 的等位变异影响抗性淀粉含量

对HJX74 和位于第6 号染色体上的7 份SSSLs(02-06、08-06、12-06、14-06、15-06、18-06 和21-06) 的SSIIa基因序列进行测序分析。结果发现HJX74 和这7 份SSSLs 在SSIIa的第8 外显子中有4 个SNPs，即G/A、G/T、G/T 和C/T，可分为3 种单倍型。在第8 外显子的4 个SNPs 中，位于第334 碱基由G 变为A，导致第604 位氨基酸由Gly 变为Ser；位于第865 碱基由C 变为T，导致第781 位氨基酸由Leu 变为Phe。结合HJX74 和7 份SSSLs 的SSIIa基因序列和表型变异连锁分析，可将这8 个材料的3 种单倍型分为3 种等位基因，分别为SSIIa-1、SSIIa-2和SSIIa-3。携带SSIIa-1等位基因的08-06 抗性淀粉含量为3.37%，显著高于其他材料；携带SSIIa-2等位基因的21-06 抗性淀粉含量次之，为2.19%；携带SSIIa-3等位基因的02-06、12-06、14-06、15-06、18-06 和HJX74 的抗性淀粉含量最低，在0.71%～0.83% 之间(表3、图4a)。SSIIa 蛋白有2 个功能结构域Glyco_transf_5 和Glycos_transf_1，Glyco_transf_5 为淀粉合成酶的催化结构域，Glycos_transf_1 具有糖基转移酶的作用，604-Gly/Ser 位于2 个功能域之间，781-Leu/Phe 紧挨着功能域Glycos_transf_1 的C 端(图4b)。SSIIa-1、SSIIa-2和SSIIa-3编码的3 个等位变异蛋白的三级结构没有差异(图4c)。

2.4 ISA1 的等位变异及对抗性淀粉含量的影响

对HJX74 和位于第8 号染色体的8 份SSSLs(04-08、05-08、07-08、08-08、09-08、11-08、13-08 和14-08)的ISA1基因序列进行测序分析。结果发现HJX74 和这8 份SSSLs 的ISA1编码区序列存在1 个Indel 和4 个SNPs，即AGG/---、C/T、C/T、C/T 和G/T，可分为4 种单倍型。第1 外显子的第209～211 的3 个碱基缺失，导致第70 位氨基酸Glu 缺失；位于第17 外显子的第117 碱基由C 变为T，导致第717 位氨基酸由Thr 变为Met。结合HJX74 和这8 份SSSLs 的ISA1基因序列和表型变异连锁分析，可将这9 个材料的4 种单倍型分为3 种等位基因，分别为ISA1-1、ISA1-2和ISA1-3。携带ISA1-1等位基因的09-08 和11-08 抗性淀粉含量分别为2.17%和2.02%，显著高于其他材料；携带ISA1-2等位基因的08-08 抗性淀粉含量为1.07%；携带ISA1-3等位基因的05-08、13-08、14-08、04-0 8、0 7-0 8 和H J X 7 4 的抗性淀粉含量在0.65%～0.83%之间(表4、图5a)。ISA1 蛋白有2 个功能结构域C B M_4 8 和A l p h a-a m y l a s e，CBM_48 具有水解酶活性，Alpha-amylase 是催化活性功能域，70-Glu/—紧挨着功能域CBM_48 的N 端，717-Thr/Met 位于ISA1 蛋白的C 端(图5b)。ISA1-3编码的蛋白缺失了1 个氨基酸Glu，与ISA1-1、ISA1-2编码的等位变异蛋白的三级结构有略微差异(图5c)。

图5 SSSLs 中的ISA1 等位变异Fig. 5 The allelic variations of ISA1 in SSSLs

表4 SSSLs 中的不同ISA1 等位基因的基因型和表型Table 4 Genotypes and phenotypes of different ISA1 alleles in SSSLs

3 讨论与结论

前人利用突变体材料研究表明，SBEIIb、SSIIa和ISA1等水稻胚乳淀粉生物合成相关基因影响了胚乳淀粉的理化性质，进而影响了抗性淀粉的形成[10-11,14,23]。本研究利用HJX74-SSSL 文库材料筛选到2 0 份S S S L s 分别携带了供体来源的SBEIIb、SSIIa或ISA1的基因座位。这20 份SSSLs 的抗性淀粉含量在0.61%～3.41%之间，其中有8 份SSSLs 的抗性淀粉含量显著高于HJX74，在1.02%～3.41%之间，表现出高抗性淀粉含量。综上结果表明，淀粉生物合成相关基因SBEIIb、SSIIa和ISA1与抗性淀粉含量密切相关，而且存在不同的自然等位变异，影响抗性淀粉含量。SBEIIb对支链淀粉短链的合成至关重要，同时也是影响抗性淀粉形成的关键基因[24-25]。很多研究者利用T-DNA 或CRISPR/Cas9 等技术获得SBEIIb功能缺失的高抗性淀粉突变体，SBEIIb 酶活性丧失，使得支链淀粉短链合成受阻，导致直链淀粉含量显著增加，中长支链淀粉链比例增加，继而导致抗性淀粉含量增加10 倍左右，说明SBEIIb负调控抗性淀粉含量[12,26-28]。本研究鉴定到2 种影响抗性淀粉含量的SBEIIb等位基因SBEIIb-1和SBEIIb-2。SBEIIb-1和SBEIIb-2在第4 外显子的第96 碱基G/A 突变，引起196-Arg 变为196-His，196-Arg/His 位于功能域CBM_48，与水解酶活性相关。196-Arg 可能导致SBEIIb-1 酶活性降低，支链淀粉短链比例降低，继而提高抗性淀粉含量。

SSIIa基因编码可溶性淀粉合成酶IIa，是一个控制稻米糊化温度的主效基因(ALK)[29]。根据第8 外显子的2 个SNPs(G/A 和C/T) 将ALK分为3 种等位基因，ALKa(A-C)和ALKb(G-T)等位基因编码的SSIIa 酶具有约10% 的活性，而ALKc(GC)等位基因编码强活性的SSIIa 酶，2 个SNPs 影响了SSIIa 酶活性[29-30]。SSIIa 酶负责合成支链淀粉中的中长分支，中长支链比例高的淀粉更容易形成高结晶度的淀粉晶体(B-型淀粉晶体)，很难被消化降解，进而增加抗性淀粉含量[7,11,31]。本研究鉴定到SSIIa的3 种等位基因SSIIa-1、SSIIa-2和SSIIa-3影响抗性淀粉含量，这3 个等位基因在第8 外显子存在2 个SNPs(Ex8-334G/A 和Ex8–865C/T)引起2 个氨基酸的序列变异(604-Gly/Ser 和781-Leu/Phe)。其中，SSIIa-1的Ex8-334G 和Ex8-865C 导致第604 和781 位氨基酸分别为Gly 和Leu，表现为高抗性淀粉含量，为3.37%。以上结果表明，2 个位点(604-Gly/Ser 和781-Leu/Phe)的氨基酸变异影响了抗性淀粉的含量。781-Leu/Phe 紧挨着功能域Glycos_transf_1 的C 端。有研究表明，781-Leu/Phe 是影响SSIIa 酶催化活性的关键位点，7 8 1-L e u 的酶活性显著高于7 8 1-P h e；6 0 4-Gly/Ser 对SSIIa 酶催化活性起到修饰作用，604-Gly 的酶活性要略高于604-Ser[32]。SSIIa-1表现出高抗性淀粉含量，可能是因为SSIIa-1编码的SSIIa 酶(604-Gly 和781-Leu)具有较强的催化活性，促进了支链淀粉中的中长链比例显著增加，继而导致抗性淀粉含量增加。

Bao 等[7]通过全基因组关联分析，鉴定到抗性淀粉相关候选基因ISA1。ISA1编码淀粉去分支酶，去除α-D-1,6-糖苷键，影响和修饰支链淀粉的链长分布和分子特性，增加了直链淀粉和支链淀粉的比例，从而影响抗性淀粉的含量，进而推测ISA1与抗性淀粉有关[7,21,23]。本研究鉴定到ISA1的3 种等位基因ISA1-1、ISA1-2和ISA1-3，其抗性淀粉含量分别为2.09%、1.07%和0.76%。这3 个等位基因编码区序列的1 个Indel(AGG/---) 和1 个SNP(Ex17-117C/T)，导致第70 位氨基酸Glu 缺失和第717 位氨基酸由Thr 变为Met，ISA1 蛋白N 端的70-Glu 缺失引起了蛋白三级结构的微小差异。ISA1-1编码区的AGG 插入和Ex17-117C 导致第70 和717 位氨基酸为Glu 和Thr，表现为高抗性淀粉含量。综上结果表明，ISA1的2 个变异位点Indel(AGG/---) 和SNP(Ex17-117C/T) 都影响了ISA1 蛋白功能，进而影响抗性淀粉含量，产生3 种不同的等位基因。

目前，大多数水稻品种的抗性淀粉含量低于1%，只有极个别品种的抗性淀粉含量能接近3%[7,33]。近年来，通过理化诱变、RNA 干扰和基因编辑技术创制了多个与SBEIIa、SBEIIb和SSIIIa等淀粉合成相关基因突变的高抗性淀粉材料和品系，其抗性淀粉含量大都在10% 左右，高抗性淀粉突变体材料往往表现出产量低和较差的蒸煮食味品质，很难直接应用于培育新品种[10-12,14]。广东省植物分子育种重点实验室已构建了HJX74-SSSL 分子设计育种平台，设计聚合了不同优异性状的等位基因，培育了多个高产、优质和多抗的新品种(系)[22]。因此，基于HJX74-SSSL 分子设计育种平台，利用本研究鉴定到的3 个自然变异的高抗性淀粉含量的等位基因SBEIIb-1、SSIIa-1和ISA1-1对高产、优质和多抗的水稻品种(系)再进行定向改良，将是培育高抗性淀粉含量水稻新品种的有效途径。