mNGS 在鹦鹉热衣原体肺炎中的应用价值*

马晶，杨舒婷，杨敏，黄国虹，王昌敏（新疆维吾尔自治区人民医院临床检验中心，乌鲁木齐 830001）

鹦鹉热衣原体（Chlamydiapsittaci，Cps）是人兽共患病病原体，其感染的肺炎约占社区获得性肺炎的1%［1-3］。鹦鹉热衣原体肺炎发病率低，临床症状特异性低。常规检测方法包括血清学及分子生物学检验等［4-5］，上述检测方法周期长、阳性率低，易受抗生素治疗的干扰，不能满足临床快速、准确诊断的需求，导致临床对鹦鹉热衣原体肺炎诊断困难，常被漏诊或误诊。由于宏基因组二代测序技术（metagenomics next generation sequencing，mNGS）［6-8］具有无偏倚、广覆盖的优势，目前已广泛应用于临床，提高了鹦鹉热衣原体的检出率，从而使临床医师能够对其进行及时有效的针对性治疗。本文回顾性总结了17 例鹦鹉热衣原体肺炎患者的临床资料，分析其临床病理参数及实验室检查指标，以期为诊断及治疗鹦鹉热衣原体肺炎提供参考。

1 材料和方法

1.1 研究对象 对2021 年7 月至2022 年8 月由新疆维吾尔自治区人民医院收治的且经mNGS 检测为鹦鹉热衣原体肺炎患者17 例进行回顾性分析，男11 例，女6 例，年龄33～78 岁。对其一般资料、基础疾病及临床病理参数进行汇总。纳入标准：（1）患者临床资料完整。（2）患者均经mNGS检出鹦鹉热衣原体。排除标准：（1）合并其他系统感染者。（2）合并其他恶性肿瘤者。

1.2 主要仪器及试剂 BC-6800PLUS 全自动细胞分析仪（深圳迈瑞生物医疗电子公司），ACL TOP750 LAS 全自动血凝分析仪（北京沃芬医疗器械商贸公司），c16000 全自动生化分析仪（美国Abbott 公司），cobas e411 电化学发光分析仪（德国Roche 公司），MGISEQ-2000 测序仪（深圳华大智造科技公司），C1000 梯度PCR 仪（美国Bio-Rad公司），QubitTM4 浓度测定仪、Invitrogen QubitTMdsDNA HS Assay 试剂盒、Invitrogen QubitTMssDNA HS Assay 试剂盒（美国赛默飞公司），病原破壁试剂盒（溶壁酶）、核酸提取或纯化试剂、基因组DNA 片段化试剂盒、测序反应通用试剂盒（武汉华大智造科技公司）。

1.3 标本采集 患者在抗菌药物使用前，空腹采集静脉全血标本2 mL，EDTA-K2抗凝，8 h 内4 ℃、1 600×g离心10 min，收集300 μL 血浆。肺泡灌洗液或气管抽吸物按照无菌操作要求留取1 mL。标本置于-70 ℃保存。

1.4 血液学指标检测 采用BC-6800PLUS 全自动细胞分析仪检测血常规各项参数，ACL TOP750 LAS 全自动血凝分析仪检测凝血指标，c16000 全自动生化分析仪和cobas e411 电化学发光分析仪检测生化指标。血液学各指标参考区间：白细胞计数：［WBC：（3.5～9.5）×109／L，电阻抗法］；中性粒细胞百分比（NEUT%：40%～75%，电阻抗法）；淋巴细胞百分比（LY%：20%～50%，电阻抗法）；C 反应蛋白（CRP：0～8 mg／L，免疫比浊法）；纤维蛋白原（Fib：2.0～4.0 g／L，凝固法）；D-二聚体（D-D：0～0.5 mg／L，免疫比浊法）；丙氨酸氨基转移酶（ALT：9～60 U／L，速率法）；天冬氨酸氨基转移酶（AST：15～45 U／L，速率法）；肌酸激酶（CK：50～310 U／L，速率法）；乳酸脱氢酶（LDH：120～250 U／L，速率法）；肌钙蛋白T（cTnT：0～0.014 ng／mL，电化学发光法）；B 型钠尿肽（BNP：0～100 pg／mL，化学发光法）；清蛋白（Alb：40～55 g／L，比色法）。

1.5 mNGS 检测 取患者的肺泡灌洗液或气管抽吸物450 μL，加入7.2 μL 溶壁酶温浴（30 ℃、10 min），加入玻璃珠进行物理破壁，混合震荡后取300 μL 进行DNA 提取，阴、阳性质控品处理同实验标本。提取后的DNA 使用QubitTM4 浓度测定仪测定浓度，取43 μL 浓度检测合格的核酸标本进行酶切片段化、构建文库（末端修复、接头连接及PCR扩增）。按照QubitTMdsDNA HS Assay 试剂盒说明书进行文库浓度的质控，根据检测后的浓度将构建好的文库按照等质量进行pooling，将pooling 混合后的文库经环化形成单链环形结构，再经滚环复制（RCA）生成DNB 纳米球，制备好的DNB 纳米球加载至测序芯片，使用MGISEQ-2000 测序仪进行测序。测序数据下机后去除低质量的序列以获得高质量的数据。通过BWA（BWA：http：／／bio-bwa.sourceforge.net／）比对，高质量数据中比对上人参考基因组序列的数据去除，剩下的数据在去除低复杂度reads 后与华大PMDB 病原数据库进行比对，获得能够匹配到某种病原体的序列数，根据序列数的高低以及临床其他检测判读可能的病原体。对于实验检测结果，先根据序列数的多少及种属的排列位置，选取排名靠前的种属且有致病性的病原体，结合临床症状和其他实验检测结果，综合判定致病微生物［6-10］。

2 结果

2.1 鹦鹉热衣原体肺炎患者基本信息与临床病理参数 17 例诊断为鹦鹉热衣原体肺炎患者中，除6例无基础病史外，其余均有高血压、脑梗等病史。5例有鸟类、禽类接触史，3 例不详。临床表现除2 例外其余均有发热现象。见表1。

表1 17 例鹦鹉热衣原体肺炎患者的临床病理参数

2.2 各项实验室检查结果 17 例患者中，有3 例患者白细胞计数升高，6 例患者中性粒细胞百分比明显增高，17 例患者C 反应蛋白、纤维蛋白原、D-二聚体均升高，11 例患者乳酸脱氢酶和7 例患者B 型钠尿肽升高，15 例患者淋巴细胞百分比和14 例患者清蛋白降低。见表2。

表2 17 例鹦鹉热衣原体肺炎患者实验室检查结果分析

2.3 鹦鹉热衣原体肺炎患者mNGS 检测结果 17例鹦鹉热衣原体肺炎患者的mNGS 检测结果见表3。其中9 例患者只检出鹦鹉热衣原体，另有部分患者还检出金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌等细菌，烟曲霉等真菌以及疱疹病毒。

表3 17 例鹦鹉热衣原体肺炎患者mNGS 检测结果

3 讨论

鹦鹉热衣原体是人畜共患病病原体［11］，主要宿主为鹦鹉、鸽子等鸟类。人类多因吸入鸟类排泄物的气溶胶引起肺炎［12］，患者年龄多集中于中年人，且男性发病率高于女性［13］。本研究中感染者平均年龄为57 岁；男性占比64.71%，女性占比35.29%；其中29%的感染者有鸟类接触史；88%的感染者有发热症状，符合该病的流行病特征［14］。由于该病临床症状不典型，因此对于有鸟类或禽类接触史的发热患者，需警惕鹦鹉热衣原体感染，尽早进行诊断。

研究表明，鹦鹉热衣原体肺炎患者通常白细胞计数正常或轻微升高、中性粒细胞百分比、C 反应蛋白、降钙素原、肌酸激酶、乳酸脱氢酶明显升高。如果合并系统性疾病，患者可出现转氨酶升高、低蛋白血症、低钠血症和肾功能损害［15］。本研究的实验室检查结果证实，患者的白细胞计数、C 反应蛋白均升高，可作为感染的客观指标。而淋巴细胞百分比下降，提示鹦鹉热衣原体可能易于在免疫功能低下的宿主中引起感染。

本研究中17 例患者mNGS 检出鹦鹉热衣原体核酸序列，结合临床表现及接触史明确诊断为鹦鹉热衣原体肺炎。患者从出现临床症状到检出鹦鹉热衣原体平均时间为5 d，部分病例检出鹦鹉热衣原体核酸序列数较多，这可能与检测的标本类型、病情严重程度等有关。本次研究中还检出其他病原体，但需结合患者临床病理参数、实验室检查结果及检出的序列数等综合判定是否为感染的致病菌。17 例患者在mNGS 检测结果显示为鹦鹉热衣原体感染后，根据患者病情严重程度、治疗效果、病程时间等选择性加用其他抗菌药物治疗，均好转出院。这充分说明应用mNGS 技术在17 例患者的诊治过程中显示出了特有的优势，提高了鹦鹉热衣原体肺炎诊断的准确性，提示临床应尽早进行精准的抗感染治疗，减少不必要抗菌药物的使用，改善了患者预后。然而，目前mNGS 技术的结果解读尚无统一的标准，致病菌和背景菌区分较难。本次实验纳入的病例数较少，这是本研究的不足之处，后期将继续扩大样本量对其进行更深入研究，以期更好地指导临床诊断及治疗。