CXCL16 对霍奇金淋巴瘤HRS 细胞与Treg 淋巴细胞关系的影响

杨 画，寻 阳，刘 芳，吴鸿发，汤红平

（1.佛山科学技术大学 医学院，广东 佛山 528225；2.干细胞转化研究中心，香港 999077；3.南方医科大学附属深圳妇幼保健院 病理科，深圳 518028）

霍奇金淋巴瘤（Hodgkin’s Lymphoma，HL）是最常见的淋巴系统恶性肿瘤之一，其中，经典型的霍奇金淋巴瘤（Classical Hodgkin-Lymphoma，CHL）可分为4 种组织学类型：淋巴细胞为主型、结节硬化型、混合细胞型和淋巴细胞耗竭型［1］。CHL 的特征性病理形态表现为肿瘤细胞-里德-斯特恩伯格（Hodgkin Reed-Sternberg，HRS）细胞与异质性非肿瘤炎性细胞混合存在。CHL 中的HRS 细胞仅占肿瘤组织的不到1%，其余绝大部分组成均为非肿瘤性的炎性细胞［1］。CHL 背景炎症细胞主要由CD4+T 淋巴细胞，特别是CD4+CD25+双表达的调节性T（T regulatory，Treg）淋巴细胞构成［2］。而细胞因子和趋化因子在HRS细胞与其肿瘤微环境之间关系中发挥了重要作用。

CXC型趋化因子配体16（C-C-X Motif Chemokine Ligand 16，CXCL16），亦被称为趋化因子CXCL16，最早被发现在动脉粥样硬化、肝炎、狼疮性肾炎、风湿免疫、艾滋病等免疫疾病或炎症相关疾病中发挥作用［3］。近年来，随着研究的深入，CXCL16 在多种恶性肿瘤中的表达及其功能受到越来越多的关注。我们前期发现HL 组织和细胞水平均为高表达CXCL16。本研究拟进一步探讨CXCL16 在HL 肿瘤细胞与Treg 淋巴细胞相互关系中的作用，从免疫学角度为HL 的发生、发展及预后评估提供新的相关指标。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株

人HL 细胞株L428 由南方医科大学（广东省分子肿瘤病理重点实验室）保存并馈赠。外周血经过肝素抗凝处理后进行单核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells，PBMC）的提取。新鲜外周血提供自广东省肇庆市中心血站。

1.1.2 主要试剂

1640 培养基、FBS 及青霉素-链霉素双抗均购自Gibco 公司（美国），DMSO 购自吉诺公司（中国，广州），磁珠分选试剂盒（Pan CD4+CD25+T cell isolation kit II）购自美天妮公司（德国），重组人可溶性CXCL16（soluble CXCL16，sCXCL16）蛋白购自R&D 公司（美国），重组人白细胞介素3（Interleukin-3，IL-3）蛋白购自Protech 公司（美国），CCK8 细胞增殖试剂盒购自同仁公司（日本），Transwell 小室（孔径8%μm）、共培养小室（聚碳酸酯微孔膜孔径0.4 μm）均购自Corning 公司（美国）。

1.2 方法

1.2.1 生物信息学分析

选取“Tumor B-cell lymphoma Xiao 420-MAS5.0-U133p2”公开数据库，使用R2:Genomics Analysis and Visualization Platform 进行分析，绘制Kaplan-Meier 生存曲线。

1.2.2 免疫磁珠法分选CD4+CD25+Treg 淋巴细胞

人外周血单核细胞的分离采用常规的密度梯度离心法。根据磁珠试剂盒说明书操作对PBMC 细胞进行磁珠分选。随后，将分选所获得的CD4+CD25+双表达的Treg 淋巴细胞移入培养箱内过夜。次日加入植物凝集素，继续培养并观察淋巴细胞状态。

1.2.3 L428 细胞与Treg 淋巴细胞共培养

分直接共培养与间接共培养。直接共培养是将CD4+CD25+双表达的Treg 淋巴细胞与L428 细胞按1∶100 的比例加入培养瓶。间接共培养是选取共培养小室（0.4%μm），将L428 细胞和CD4+CD25+Treg淋巴细胞分别置于下室和上室中。定时记录细胞形态、大小及生长情况，观察其相互影响。

1.2.4 Treg 淋巴细胞趋化试验

Treg 淋巴细胞首先使用无血清的1640 培养基饥饿4 h，再将Transwell 小室置入含1640 基础培养基的24 孔板中，分别加入不同浓度sCXCL16，Transwell 试验趋化Treg 淋巴细胞至下室，CCK8 法检测下室细胞OD 值。

1.2.5 L428 细胞和Treg 淋巴细胞间接共培养

根据前期报道［4］，试验组Treg 淋巴细胞先置于共培养小室内，24 孔板内放置L428 细胞，随后，将共培养小室轻轻放入24 孔板内。Treg 淋巴细胞和L428 细胞可以通过孔膜进行物质交流，但细胞不能穿过小孔产生直接接触。对照组上室小室内不放置Treg 淋巴细胞，24 孔板内同样放置L428 细胞。每24 h 利用CCK8 细胞增殖试剂盒检测上、下室细胞OD 值。

1.2.6 IL-3 对L428 细胞增殖能力的影响

检测前将L428 细胞密度调整为1×104/mL。对照组为常规培养基培养的L428 细胞。试验组为加入重组人IL-3 的培养基，IL-3 设置三个浓度梯度组，分别为10 μg、20%μg 和50 μg。每天采用CCK-8细胞增殖试剂盒检测各组细胞OD 值。

1.3 统计学处理

应用GraphPad Prism 6 及SPSS 13.0 统计分析软件对所获得的试验数据进行统计学分析，采用单因素方差分析。方差齐使用LSD 法分析，方差不齐使用Dunnea T3 法分析。

2 结果

2.1 CXCL16 表达与HL 患者预后的关系

通过https://hgserver1.amc.nl/cgi-bin/r2/main.cgi 网址检索R2：Genomics Analysis and Visualization Platform 中HL 组织样本中差异表达基因的数据库，确定其中CXCL16 的表达水平，再根据CXCL16 基因表达丰度绘制Kaplan-Meier 预后关系曲线，并用对数秩检验进行统计分析。结果显示，CXCL16 的表达量与患者的总生存期长短呈负相关（P=0.030），提示CXCL16 表达较高的HL 患者预后不良（见图1）。

图1 CXCL16 表达与HL 患者预后关系（Kaplan-Meier 曲线）

图2 不同浓度sCXCL16 对Treg 淋巴趋化能力比较（*P＜0.05）

2.2 CXCL16 对Treg 淋巴细胞的趋化作用

试验按照如下分组：对照组（裸细胞）、sCXCL16-10 ng/mL、sCXCL16-20 ng/mL 和sCXCL16-50 ng/mL。结果显示：加入sCXCL16 的试验组下室Treg 淋巴细胞OD 值均显著高于对照组，存在统计学差异（均P＜0.05）；试验组下室Treg 淋巴细胞OD 值与加入sCXCL16 浓度呈正相关，不同浓度组间存在统计学差异（均P＜0.05）。试验结果提示，sCXCL16 对Treg 淋巴细胞具有趋化作用，且趋化能力存在剂量效应，能随着CXCL16 浓度增加而相应增加。

2.3 Treg 与L428 细胞共培养观察

2.3.1 L428 细胞与Treg 淋巴细胞直接共培养中细胞形态变化

试验组为L428 和Treg 淋巴细胞共培养组，对照组为单独L428 培养组。倒置显微镜下观察24 h 至72 h 的细胞生长状态。结果显示，24 h 后可见试验组L428 细胞（图3B）成团性稍高于对照组单独培养的L428 细胞（图3A）；72 h 后试验组的L428 细胞（图3D）成团性显著高于对照组，且单个细胞数量明显少于对照组（图3C）。直接共培养提示，Treg 淋巴细胞可促进L428 细胞增殖中成团性的出现和维持。

图3 L428 细胞与CD4+CD25+Treg 淋巴细胞直接共培养

2.3.2 L428 细胞与Treg 淋巴细胞间接共培养细胞增殖能力的检测

试验组为间接共培养的L428 细胞和CD4+CD25+双表达的Treg 淋巴细胞，对照组对单独培养的L428 细胞和CD4+CD25+双表达的Treg 淋巴细胞。结果显示，除第1、2 天外，第3～5 天试验组L428 细胞（图4A）和Treg 淋巴细胞（图4B）的OD 值均高于对照组（均P＜0.05）。提示，间接共培养条件下L428 细胞和Treg 淋巴细胞能互相促进增殖。

图4 L428 细胞与CD4+CD25+Treg 淋巴细胞进行间接共培养后的增殖能力的检测

2.4 IL-3 能促进L428 细胞体外增殖

体外增殖试验分为4 组：对照组、IL-3（10%μg/mL）组、IL-3（20 μg/mL）组和IL-3（50%μg/mL）组。第1、2 天（D1、D2）各组间差异不显著（见图5A、B），从第3 天到第5 天（D3～D5）各试验组与对照组开始出现统计学差异（P＜0.05），且除了D3 的10%μg/mL 与20%μg/mL 组间（P=0.137）以及D5 的20%μg/mL 与50 μg/mL 组（P=0.141）未见明显差异外，其余各试验组间均有统计学差异（均P＜0.05）（见图5C～E）。细胞增殖曲线同样显示重组人IL-3 可促进L428 细胞体外增殖，而且IL-3 浓度越高，其对L428 细胞增殖促进能力越强（图5F）。

图5 不同浓度IL-3 对L428 细胞增殖的影响

3 讨论

肿瘤微环境是肿瘤的关键特征，是肿瘤生存、发展和免疫耐受与逃避的基础［5］。经典型霍奇金淋巴瘤病理形态学特征具有特异性，即背景细胞绝大部分成为是炎性细胞，如中性粒细胞、T 淋巴细胞、B 淋巴细胞等，只有不到1%的诊断性HRS 细胞。HRS 细胞不仅可以分泌包括细胞因子和趋化因子在内的多种因子，也可以通过所分泌的细胞因子和/或趋化因子，吸引和维持对自身存活和生长有利的背景细胞，如中性粒细胞、T 淋巴细胞、B 淋巴细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、成纤维细胞及肥大细胞等。这些被吸引而来的炎性细胞也能够分泌大量细胞因子，反作用于HRS 细胞。因此，细胞因子/趋化因子与背景细胞二者之间形成一个能够相互作用的分子网络，共同维系HRS 细胞的存活并促进HRS 细胞的增殖［6-7］。趋化因子CXCL16 已被证实在多种恶性肿瘤中的表达，并且与肿瘤发生、发展密切相关［8-11］。经过文献调研，CXCL16 与HL 的关系的研究鲜见报道。我们前期基于公共基因芯片数据库GEO 进行数据分析，发现CXCL16 在HL 中高表达，这与Hanamoto 等［12］在HL 来源细胞株发现的CXCL16 表达结果一致。本研究中，我们首先通过生物信息学分析明确CXCL16 与HL 不良预后密切相关。提示CXCL16 及其受体CXCR6 可能参与了HL 肿瘤微环境细胞因子和趋化因子分子网络。

根据已有报道，肿瘤微环境中CD4+CD25+双表达的Treg 淋巴细胞在HL 的发生、发展中发挥了重要作用。CD4+CD25+双表达的Treg 淋巴细胞不仅能够直接维持HRS 细胞的存活并促进HRS 细胞的增殖，还能通过局部免疫抑制作用，帮助HRS 细胞免受免疫监视和逃避免疫清除［13］。与正常人相比，HL患者外周血中CD4+CD25+双表达的Treg 淋巴细胞数量不仅显著增加［14］。而且Treg 淋巴细胞的数量也与患者的预后呈负相关：HL 患者的Treg/ 辅助性T 细胞的比值越高，无病生存期（Disease-Free Survival，DFS）则越短［15］。本研究结果显示，外源性添加人重组的可溶性CXCL16 蛋白后，对Treg 淋巴细胞具有显著的趋化作用，并与剂量呈正相关。随后我们将L428 细胞与CD4+CD25+双表达的Treg 淋巴细胞进行直接共培养和间接共培养，发现Treg 淋巴细胞不仅能够促进L428 细胞的成团性生长并提高其增殖能力，而且L428 细胞也能反作用于Treg 淋巴细胞，提高其增殖能力。上述结果提示HRS 细胞可能通过分泌CXCL16 吸引和富集Treg 淋巴细胞，并通过与后者相互作用，以诱导产生和维持对自身有利的肿瘤微环境。

文献调研发现，肿瘤微环境中的Treg 淋巴细胞分泌IL-3 后，HRS 能够吸引IL-3 作用于自身的IL-3 受体，进而发挥作用［16-17］。因此，IL-3 可能是HRS 细胞与肿瘤微环境中的Treg 细胞进行“分子对话”中重要介质之一。我们接下来便观察了IL-3 对HRS 细胞增殖的影响。研究结果发现，添加重组人IL-3 可促进L428 细胞的体外增殖能力，而且与IL-3 浓度呈正比。Varricchi G 等人指出，IL-3 是肿瘤微环境中重要的炎性介质，能增强人体免疫系统对于疾病的天然响应。除了本研究中的Treg 淋巴细胞，还有多种炎性细胞，如细胞毒性T 淋巴细胞、中性粒细胞及辅助性T 细胞等均可生成和分泌IL-3%［18］。值得注意的是，IL-3 不仅可以作用于HRS 细胞，对Treg 淋巴细胞本身也有作用［19］。由于Treg 淋巴细胞不仅是HRS 细胞周围数量最多的，而且也是最直接接触HRS 细胞的背景细胞，所以，Treg 淋巴细胞产生和分泌的IL-3 对HRS 细胞的作用非常值得淋巴瘤领域的学者关注。

综上所述，本研究推测HL 肿瘤细胞可高表达CXCL16，进而趋化Treg 淋巴细胞，趋化而来的Treg淋巴细胞可通过分泌IL-3 促进HRS 细胞的增殖；同时，HRS 细胞也能反作用于Treg 淋巴细胞促进其增殖能力。上述的环状机制可能直接影响霍奇金淋巴瘤的进展和患者预后，并为研究HL 肿瘤微环境分子网络提供全新的理论依据。然而，由于HL 微环境背景细胞复杂，趋化因子CXCL16 对于HL 其他背景细胞，如其他T 淋巴细胞、B 淋巴细胞、中性粒细胞、肥大细胞及嗜酸性粒细胞等的作用如何，尚待后续研究进一步证实。