猪源性成分检测方法验证分析

石 旺，杨 冰，陈帅虎，何雅媛，何 浩

（湖南省产商品质量检验研究院，湖南长沙 410007）

近年来，因食品假冒伪劣、真伪难辨而产生的食品安全问题越来越多[1-2]。食品真伪的检测技术包括基于核酸检测、蛋白分析检测和质谱检测等手段[3-4]，其中聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是核酸检测技术中常用的方法，该方法是以DNA或者RNA分子为模板在体外进行扩增检测的技术，是一种脱离活体进行微量/痕量分析的技术[5]。PCR技术始于20世纪80年代，具有检测速度快、灵敏度高等优点，已衍生出巢式PCR、测序PCR、实时荧光PCR、数字PCR以及PCR芯片等技术。其中实时荧光PCR能够实时监测PCR的扩增过程，在生物学、食品、临床医学等领域应用广泛[6-7]。

目前，针对转基因成分及动物源性成分主要采用实时荧光PCR检测方式[8]。为确保实时荧光PCR技术检测结果的可靠性和重复性，许多领域颁布了相关指南，如2009年首个国际化标准指南——MIQE（Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments）[9]发布，该标准为实时荧光PCR技术提供了思想指导，为其他应用领域的发展奠定了基础[10]。根据每年参加能力验证的报告和文献报道可知，对于食品领域动物源性成分的检测合格率几乎达不到100%满意[11-12]。国家认证认可监督管理委员会发布了《基因扩增检测方法确认与验证指南》（RB/T 032—2020），该标准旨在帮助实验室提高基因扩增检验水平，要求对实验室引入的标准检验方法进行验证。

本研究依据《肉及肉制品中动物源性成分的测定 实时荧光PCR法》（SB/T 10923—2012）和《基因扩增检测方法确认与验证指南》（RB/T 032—2020），对猪源性成分进行引物扩增效率、检出限和基质等参数研究，辅以能力验证结果确认验证效果，以期为同行在开展基因扩增活动时进行方法验证提供参考，提升检验质量。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

猪源性（QC-AN-003）、鸭源性（QC-AN-007），中国检科院质控样品；3116A、3116B，FAPAS能力验证样品编号。

DNA提取试剂盒（TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0），批号AL52397A，Takara生物；实时荧光PCR反应试剂盒（PerfectStart®Ⅱ Probe qPCR SuperMix），批号O20818，北京全式金生物。

1.2 引物及探针序列

猪源性成分Porcine：引物及探针购自上海生工，序列信息见《常见畜禽动物源性成分检测方法实时荧光PCR法》（SB/T 10923—2012）；内参18S rRNA：引物及探针购自上海生工，序列信息见《植物蛋白饮料中植物源性成分鉴定》（BJS 201707）。

1.3 仪器与设备

LightCycler 480II罗氏实时荧光定量PCR仪（瑞士罗氏公司）；Infinite 200 PRO TECAN多功能酶标仪（瑞士迪肯公司）；3H16RI智能高速冷冻离心机（湖南赫西仪器装备有限公司）。

1.4 实验方法

根据SB/T 10923—2012和实验组织方提供的作业指导书进行样品检测。

1.4.1 基因组DNA的提取

采用TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0试剂盒说明书进行样品基因组DNA（genomic DNA，gDNA）提取。

1.4.2 荧光定量PCR检测

依据SB/T 10923—2012中检测猪源性成分检测方法，PCR扩增体系见表1。扩增条件：50 ℃保温2 min；95 ℃预变性10 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火延伸60 s，45个循环，每个循环收集荧光信号。

表1 PCR扩增体系（20 μL）

1.4.3 检验设置

阳性对照：猪成分gDNA；阴性对照：鸭成分gDNA；空白对照：ddH2O。

2 结果与分析

2.1 方法验证

根据RB/T 032—2020要求，对定性方法进行验证需要对检出限、基质效应、重复性进行验证，因此本文通过检测扩增效率、检出限和基质参数方面，对猪源性成分进行分析。

2.1.1 Porcine引物扩增效率及检出限

实时荧光PCR扩增过程中添加不同量的猪源性gDNA，扩增结果的Ct值见表2。从表2中可以看出，随着猪源性gDNA的减少，其Porcine检测的Ct值逐渐增大，当扩增量为0.1 ng时，Ct值接近于30；18S rRNA的Ct值也随着gDNA的减少而逐渐变大。Porcine的检出限可以达到0.1 ng。

表2 PCR扩增效率

根据扩增效率MIQE标准E=10-1/k-1[9,12-13]（E代表扩增效率，k代表斜率），理想状态下，log gDNA量与Ct值存在一定的线性关系，即Y=-kX+B，X代表log gDNA量，Y代表Ct值，k代表斜率。根据表2中的Ct值和gDNA量对数作线性分析，结果见图1。

图1 Ct值与log gDNA线性关系

从图1可知，Porcine：Y=-3.395 9X+25.583，R2=0.998 5，其k=-3.395 9；18S rRNA：Y=-3.497 1X+24.97，R2=0.998 5，其k=-3.497 1。由此可得出Porcine扩增效率E=97%，18S rRNA扩增效率E=93%。表明本实验中猪源性引物扩增效率符合要求，且log gDNA与Ct值的相关系数为0.998 5。

2.1.2 不同基质影响

扩增体系加入6.0 ng gDNA，每组gDNA分别由不同量猪源性gDNA和鸭源性gDNA组成，PCR扩增结果见表3。在有其他基质干扰的情况下，分析猪源性引物扩增的Ct值与猪源性DNA对数的线性关系见图2。可以看出，添加不同量其他基质的PCR体系中，Porcine扩增曲线Y=-3.552 8X+26.27，R²=0.998 6，其k=-3.552 8，由此得出此时扩增效率E=91%；Porcine引物在有其他基质影响的情况下，其扩增效率受到了一定影响，但仍然大于90%，因此也非常理想。对于内参18S rRNA，由于有两种类型基质都可以发生扩增，但不同类型基质情况不一致，所以不便分析其线性关系。

图2 不同基质下猪源性log gDNA与Ct值线性关系

表3 不同基质的影响

2.2 FAPAS检测结果

按照SB/T 10923—2012对FAPAS能力验证样品3116A和3116B中的猪源性成分进行检测，检测结果见表4和图3。根据判断标准（Ct值≤35.0，且有典型的扩增曲线，则判定该样品含有相应的动物源性成分；Ct值＞35.0，或无典型的扩增曲线，则判定该样品不含相应的动物源性成分），样品3116A检测结果猪成分Ct值大于35.0，且无典型的扩增曲线，判定为不含猪源性成分；样品3116B检测结果猪成分Ct值小于35.0，且有典型的扩增曲线，判定为含有猪源性成分。

图3 能力验证样品扩增曲线

表4 FAPAS样品检测结果

3 讨论

内参基因又称为管家基因，用来衡量样品间的浓度和纯度差异性，可以减少实验误差，确保实验结果更加准确[13]。SB/T 10923—2012标准中没有内参要求，但基于内参的重要性，本研究增加了内参数据。在不同基质影响参数中，每个荧光定量PCR体系里面的DNA总量相等，但内参18S rRNA引物扩增出来的Ct值有一定差异，并且随着两者的混合比例发生变化，这可能与不同物种之间18S rRNA量存在差异有关[14]。在进行扩增效率的验证时，本研究的样品是质控样，还可以采用含序列的标准质粒进行实验[15]。

4 结论

本实验根据RB/T 032—2020对猪源性成分定性检测方法进行试验，通过验证该基因扩增引物的检出限、重复性和基质效应参数，最终证实本实验室满足SB/T 10923—2012的要求。同时根据验证结果对FAPAS能力验证样品进行检测，检测结果符合要求。