响应面法优化紫芦笋花青素和多糖分步提取工艺

胡媛博,杨春

(1.山西农业大学 食品科学与工程学院,山西 晋中 030801;2.山西农业大学山西功能食品研究院,太原 030001)

芦笋,又称石刁柏、龙须菜等,为百合科天门冬属多年生草本植物,被誉为“蔬菜之王”,在世界十大名菜中占有一席之地。紫芦笋,也称水果芦笋,源自美国加利福尼亚,是芦笋育种家本森在将芦笋二倍体加倍为四倍体后,从中筛选培育得到的[1]。

与常见的白芦笋和绿芦笋相比,其嫩茎通体呈现紫罗兰色,内含大量的花青素。紫芦笋的植物纤维含量较少,糖酸比较高[2],因此无苦涩味,质地细嫩,滋味鲜美,可供生食。以往我国的紫芦笋生产用种几乎全部依赖进口,其价格昂贵、品质低劣、抗病力差。为推进国内紫芦笋生产的发展,张元国、罗绍春等选育出潍紫P-7、井岗红等适合国内栽培的紫芦笋品种。

目前对植物花青素和多糖提取条件的研究大部分是单独提取[3-7],提取花青素后的植物残渣被直接丢弃,忽略了另一重要成分多糖。个别研究人员考虑到资源浪费,选择综合提取[8-9]或分步提取[10-12]植物中有效生物活性成分,但在花青素和多糖的分步提取研究中,仍专注于研究花青素的提取工艺,未对多糖的提取工艺进行优化[13-14]。本研究根据花青素和多糖理化性质的差异,采用超声波辅助提取法先对紫芦笋花青素的提取工艺进行优化,然后对经最优条件提取过花青素的紫芦笋渣进行超声辅助多糖提取工艺的优化。对紫芦笋花青素和多糖进行分步提取,不仅能为紫芦笋的综合利用提供理论与技术支撑,而且对其今后的深加工技术研究与开发也具有重要意义,同时可有效减轻社会环保压力。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

紫芦笋:由山西农业大学东阳基地提供;无水乙醇、浓盐酸、氯化钾、冰醋酸、三水合醋酸钠、浓硫酸、苯酚、葡萄糖等:均为分析纯。

1.2 仪器与设备

仪器与设备见表1。

表1 仪器与设备

1.3 实验方法

1.3.1 样品的前处理

将采好的新鲜紫芦笋洗净、切碎,真空冷冻干燥后研磨,过40目筛,置于密封袋中避光保存。

1.3.2 缓冲液配制

配制pH 1.0的KCl-HCl缓冲液和pH 4.5的CH3COONa-HCl缓冲液,具体方法参考文献[15]。

1.3.3 紫芦笋花青素的提取方法

准确称取紫芦笋冻干粉1.0 g,配制特定体积分数的乙醇溶液进行实验,按16∶1的液料比将二者加入50 mL圆底离心管中,置于旋涡振荡器上充分摇匀,然后调节超声波清洗器内水温至既定温度,将离心管放入其中辅助提取特定时间,于5 000 r/min的离心机内处理20 min后及时取出,滤除紫芦笋渣,将上清液汇集至锥形瓶中。再反复按以上步骤提取滤渣2次。然后将锥形瓶中收集到的上清液减压浓缩除去乙醇,于5 000 r/min的离心机内处理10 min后得到的上清液即为紫芦笋花青素提取液。重复3次平行实验,计算结果取平均值。

1.3.4 花青素含量的测定

取一定量样品于10 mL棕色容量瓶中,分别加入pH 1.0和pH 4.5的缓冲溶液定容,4 ℃避光平衡20 min后,以蒸馏水为空白对照,采用分光光度计在510 nm和700 nm波长处完成溶液吸光度的测定,代入下列公式计算[16-17](注:样品的最佳取用量:在510 nm波长下,稀释后测定的吸光度在0.2～0.7之间)。

A=(A510 nm-A700 nm)pH 1.0-(A510 nm-A700 nm)pH 4.5。

(1)

(2)

式中:C为花青素含量,mg/L;A为吸光度;ε为矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的吸光系数,26 900 L/(mol·cm);F为稀释因子;M为矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的摩尔质量,449.2 g/mol;d为光程,1 cm。

1.3.5 紫芦笋花青素提取单因素实验

以紫芦笋提取液中花青素含量为指标,分别考察乙醇体积分数(0%、25%、50%、75%、100%)、提取时间(10,20,30,40,50 min)、提取温度(0,20,40,60,80 ℃)3个因素对紫芦笋花青素提取的影响。

1.3.6 紫芦笋花青素提取优化实验

将单因素实验数据作为实验基础,采用三因素三水平响应面分析法优化紫芦笋花青素提取工艺,其中花青素含量为响应值,乙醇体积分数(A)、提取时间(B)、提取温度(C)3个因素为变量。响应面实验因素及水平见表2。

表2 紫芦笋花青素提取响应面实验因素及水平

1.3.7 紫芦笋渣多糖提取方法

准确称取经1.3.6所得最优工艺处理后晾干混匀的紫芦笋渣0.5 g,与蒸馏水按一定的液料比加入50 mL圆底离心管中,置于旋涡振荡器上充分摇匀,然后调节超声波清洗器内水温至既定温度,将离心管放入其中辅助提取特定时间,于5 000 r/min的离心机内处理20 min后及时取出,滤除杂质,将上清液汇集至锥形瓶中。再按以上步骤提取滤渣1次。然后将锥形瓶中收集到的上清液减压浓缩,加入4倍无水乙醇左右摇匀,于常温状态下(25 ℃)静置一夜(12 h),抽滤,加少量无水乙醇充分洗泡,将粗多糖烘干(70 ℃,7 h)称重。重复3次平行实验,计算结果取平均值。

1.3.8 多糖含量的测定

1.3.8.1 葡萄糖标准曲线的绘制

取6根20 mL具塞试管,并将其依次编号为0～5,将配制好的100 mg/L葡萄糖标准工作溶液按照0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 mL的顺序依次加入具塞试管内,取蒸馏水稀释定容至1.0 mL。在每个试管中加入1.0 mL 浓度为5%的苯酚溶液,然后将5.0 mL浓硫酸迅速注入各个试管内(移液管与试管内液面应保持垂直状态,且不可与试管壁发生碰触,以确保反应充分,同时注意反应液喷溅),静置10 min后,将试管依次置于旋涡振荡器上充分摇匀,然后将试管放置于30 ℃水浴中反应20 min,待降温后取出,采用分光光度计在490 nm处完成0～5号试管溶液吸光度的测定。重复3次平行实验,计算结果取平均值。选取葡萄糖标准液浓度(μg/mL)和吸光度(A490 nm)作为横、纵坐标,绘制葡萄糖标准曲线,完成相应的线性回归,见图1。得到回归方程:y=0.003 5x+0.136 3,相关系数R2=0.997 9。

图1 葡萄糖标准曲线

1.3.8.2 多糖得率的计算

称取样品粗多糖0.010 0 g,用蒸馏水定容至10 mL,取0.5 mL稀释20倍,取稀释液1.0 mL于20 mL具塞试管中。按照标准曲线操作步骤,测定吸光度。根据标准曲线方程计算多糖含量,多糖得率按照公式(3)计算:

(3)

式中:X为样品多糖得率,%;m为样品质量,g;m1为提取得到粗多糖的质量,g;m2为在标准曲线上查到测定液的含糖量,μg;m3为测定液中粗多糖的质量,g;V1为样品定容体积,mL;V2为测定时所用样品测定液的体积,mL;0.9为葡萄糖换算成葡聚糖的校正系数。

1.3.9 紫芦笋渣多糖提取单因素实验

以紫芦笋渣中提取到的多糖得率为指标,分别考察液料比(10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1,mL/g)、提取时间(10,20,30,40,50 min)、提取温度(20,40,60,80,100 ℃)3个因素对紫芦笋渣多糖提取的影响。

1.3.10 紫芦笋渣多糖提取优化实验

将单因素实验结果数据作为实验基础,采用三因素三水平响应面分析法优化紫芦笋渣多糖提取工艺,其中多糖得率为响应值,液料比(A′)、提取时间(B)、提取温度(C)3个因素为变量。响应面实验因素及水平见表3。

表3 紫芦笋渣多糖提取响应面实验因素及水平

1.4 数据处理

采用SPSS 28.0软件对单因素实验的数据进行分析,采用OriginPro 2021软件进行数据制图,采用Design Expert 10.0软件进行响应面实验的优化设计及结果分析。

2 结果与分析

2.1 紫芦笋花青素提取工艺优化

2.1.1 单因素实验

由图2可知,提取液中花青素含量随乙醇体积分数、提取时间、提取温度的增加呈现出相同的趋势,均为先升高至顶点后降低。

图2 不同乙醇体积分数、提取时间、提取温度对紫芦笋花青素提取效果的影响

由图2中A可知,当乙醇体积分数为75%时,提取液中的花青素含量达到最高值(42.415 2±0.650 3) mg/L,且与其他乙醇体积分数所提取的花青素含量有显著差异。因此,最适宜用于提取花青素的溶剂为体积分数75%的乙醇溶液。

由图2中B可知,在提取时间为40 min时花青素含量达到最高值(54.354 9±0.532 4) mg/L,由于花青素中所含的羟基易被氧化分解,所以40 min是紫芦笋花青素的最高提取时限。因此,最适宜的提取时间为 40 min。

由图2中C可知,当提取温度在0～40 ℃之间时,有效成分的扩散速度随着温度的升高逐渐加快,因此提取液中花青素含量随着温度的升高呈现出显著上升的趋势。但由于花青素对热敏感,当提取温度继续上升至50 ℃时,提取液中花青素含量呈现下降趋势,其主要原因是花青素的结构被较高的温度所破坏[18],进而影响提取液中花青素的含量。因此,选取40 ℃为最适宜的提取温度。

2.1.2 响应面优化实验

2.1.2.1 模型拟合

为选取紫芦笋花青素提取的最优工艺,选用中心组合Box-Behnken实验设计,结合单因素实验数据,关注提取液中花青素含量,对乙醇体积分数、提取时间和提取温度3个实验因素开展优化,共包括17组实验,其中5组(13～17号)为用于估计实验误差的重复实验,是响应面实验的零点,即区域中心点,其余12组实验为响应面实验的析因点。响应面实验设计方案及结果见表4。

表4 紫芦笋花青素提取响应面实验设计及结果

经Design-Expert 10.0软件ANOVA法分析响应面二次多项式模型的显著性。实验方差分析结果见表5。

表5 紫芦笋花青素提取回归模型方差分析

由表5可知,显著性检验中,回归模型的P<0.000 1为极显著,失拟项的P=0.121 2>0.05为不显著,说明提取液中的花青素含量与各因素的回归模型有统计学意义。3个因素中乙醇体积分数对紫芦笋花青素提取工艺的影响最小。通过多元拟合所得到的回归方程为花青素含量=+54.688 8+0.881 9A+1.452 4B-2.637 0C-0.041 7AB-0.052 2AC-3.051 0BC-9.087 0A2-3.833 8B2-7.330 1C2,且模型线性相关系数(R2)为0.989 7,校正决定系数(RAdj2)为0.976 4,预测相关系数(RPred2)为0.874 8,变异系数(C.V.)为2.44%,表明该模型具有较高的拟合度,可较好地预测实验结果,可信度较高,可以用于优化紫芦笋花青素提取的实验设计。

2.1.2.2 响应面分析与优化验证

为体现不同因素间两两交互作用,按照回归模型所作图见图3。3个响应面3D图形均是开口向下、中间高四周低的凸形光滑曲面,曲线梯度越大,表示该因素的影响越明显,等高线图的椭圆率越大,表示交互影响作用越明显。由此分析可知,提取温度对花青素提取的影响最突出,而提取温度与提取时间的交互作用最强,与方差分析的结论一致。根据上述响应面设计实验分析,确定紫芦笋花青素提取的最佳工艺条件为乙醇体积分数75.485%、提取时间42.850 min、提取温度37.605 ℃,预测提取液中花青素最高含量为55.232 mg/L。在进行实际操作时考虑到实验的切实性,故将理论工艺参数调整为乙醇体积分数75%、提取时间43 min、提取温度38 ℃,提取得到的花青素含量平均值为55.438 9 mg/L。实际实验值同响应面模型预测值存在偏差,但相差不大,排除实验过程中可能出现的误差情况,证明经响应面分析得到的回归方程合理且可靠。

图3 紫芦笋花青素提取不同因素交互作用的响应面图与等高线图

2.2 紫芦笋渣多糖提取工艺优化

2.2.1 单因素实验

由图4中A可知,多糖得率随着液料比的增大逐渐升高,在液料比达到40∶1 (mL/g)后趋于平稳,这可能是因为当液料比较低时,溶液黏稠、难以混匀,不利于样品中多糖的溶出,随着液料比的加大,多糖不断溶入提取液中,但紫芦笋中多糖含量有限,当液料比达到 40∶1 (mL/g)时样品中的多糖已完全溶出,继续增大液料比,多糖得率变化不显著。因此综合考虑,40∶1 (mL/g)可作为提取紫芦笋渣的最佳液料比。

图4 不同液料比、提取时间、提取温度对紫芦笋渣多糖提取效果的影响

由图4中B可知,随着提取时间的延长,多糖的得率呈现出先上升后下降的趋势,在20 min时达到最高值。分析原因是当提取时间过短时,紫芦笋渣多糖还未完全溶出,使得提取不充分;由于多糖提取实验前期已对紫芦笋冻干粉进行了超声辅助提取花青素,当提取时间过长时,过度的机械剪切作用也会使多糖的分子结构出现断裂,致使多糖得率下降[19-21]。因此,最适宜的提取时间为 20 min。

由图4中C可知,温度越高,多糖提取得率越大。这是由于高温增加了分子的运动速率,加速了紫芦笋渣内部多糖分子的溶出,升温至100 ℃时多糖的提取效果最好,但由于80 ℃与100 ℃时的多糖得率相比无显著性差异,出于节约能源、操作方便等多角度综合考量,选择80 ℃为最佳提取温度。

2.2.2 响应面优化实验

2.2.2.1 模型拟合

为选取紫芦笋渣多糖提取最优工艺,选用中心组合Box-Behnken实验设计,结合单因素实验数据结果,关注提取多糖得率,对液料比、提取时间和提取温度3个实验因素开展优化,共包括17组实验,其中5组(13～17号)为用于估计实验误差的重复实验,是响应面实验的零点,即区域中心点,其余12组实验为响应面实验的析因点。响应面实验设计方案及结果见表6。

表6 紫芦笋渣多糖提取响应面实验设计及结果

经Design-Expert 10.0软件ANOVA法分析响应面二次多项式模型的显著性。实验方差分析结果见表7。

表7 紫芦笋渣多糖提取回归模型方差分析

由表7可知,显著性检验中,回归模型的P<0.000 1为极显著,失拟项的P=0.104 4>0.05为不显著,说明多糖得率与各因素的回归模型有统计学意义。3个因素中提取时间对紫芦笋渣多糖提取工艺的影响最小。通过多元拟合所得到的回归方程为多糖得率=1.29+0.056A′+0.024B+0.044C-0.019A′B+9.525E-3A′C-7.55E-3BC-0.11A′2-0.042B2+0.014C2,且模型线性相关系数(R2)为0.989 1,校正决定系数(RAdj2)为0.975 1,预测相关系数(RPred2)为0.864 6,变异系数(C.V.)为1.06%,表明该模型拟合程度高,可较好地预测实验结果,可信度较高,可以用于优化紫芦笋渣多糖提取的实验设计。

2.2.2.2 响应面分析与优化验证

为体现不同因素间两两交互作用,按照回归模型所作图见图5。3个响应面3D图形均是开口向下的平滑曲面,曲线梯度越大,表示该因素的影响越明显,等高线图的椭圆率越大,表示交互作用影响越明显。由此分析可知,相较于液料比和提取时间,提取温度对多糖提取的影响更明显,而对多糖得率有强交互影响的是液料比与提取时间,与方差分析的结论一致。根据上述响应面设计实验分析,确定紫芦笋渣多糖提取的最佳工艺条件为液料比41.49∶1 (mL/g)、提取时间25.77 min、提取温度86.40 ℃,预测多糖得率最高为1.339 8%。在进行实际操作时考虑到实验的切实性,故将理论工艺参数调整为液料比41∶1 (mL/g)、提取时间26 min、提取温度86 ℃,提取得到的多糖得率为1.321 5%。实际实验值同响应面预测值存在偏差,但相差不大,排除实验过程中可能出现的误差情况,证明经响应面分析得到的回归方程合理且可靠。

图5 紫芦笋渣多糖提取不同因素交互作用的响应面图与等高线图

3 结论

本实验根据花青素和多糖的溶解性不同,利用超声波辅助法结合单因素实验与响应面设计,对紫芦笋花青素和多糖进行分步提取工艺研究,并按照pH示差法、苯酚-硫酸法分别测定提取得到的花青素和多糖含量。最终优化后的工艺条件为乙醇体积分数75%、提取时间43 min、提取温度38 ℃,花青素含量为55.438 9 mg/L,将提取花青素后的紫芦笋渣自然挥干后,再按液料比41∶1 (mL/g)加入蒸馏水、提取时间26 min、提取温度86 ℃,多糖得率为1.321 5%。为超声波辅助法分步提取紫芦笋花青素和多糖的研究提供了一定的理论支撑,提高了紫芦笋的综合利用率,也为其他植物的分步提取提供了理论参考。