不同来源多肽热反应风味成分对比分析

胡靖,李凡,熊建,李沛,李库,覃先武

(酵母功能湖北省重点实验室,湖北 宜昌 443000)

美拉德反应是高温下醛类、酮类、还原糖的羰基与氨基酸、肽、蛋白质等含氮化合物的游离氨基之间发生羰氨反应,并经过缩合、聚合反应后形成类黑精的过程[1-2]。在美拉德反应过程中会形成大量的风味物质,因此一些香精的生产过程中会利用美拉德反应的技术生成不同肉类型风味的香精,此类技术生产的香精也称为热反应肉味香精。目前作为热反应肉味香精的主要多肽原料包括各种动植物蛋白酶解液,如Wu等[3]采用风味蛋白酶酶解大豆蛋白获得大豆肽,然后与核糖、半胱氨酸进行美拉德反应制备肉味香精;Liu等[4]通过酶解鸡肉获得鸡肉肽,与木糖进行美拉德反应,制备鸡肉味香精;曾晓房等[5]利用酵母抽提物进行热反应制备牛肉味香精。多肽作为美拉德反应主要的反应原料,其不同游离氨基酸比例、分子量大小、寡肽种类均对热反应的风味具有较大的影响,因此酶解工艺的不同会导致其在热反应中出现截然不同的风味。在制备热反应的肉味香精工艺中,一般都会添加含硫化合物进行反应来增强反应产物的肉香味,主要添加的化合物是半胱氨酸和硫胺素,反应过程中会形成2-甲基-3-巯基呋喃等肉香风味的含硫化合物,但是含硫化合物的阈值较低,含量过高时会明显出现硫臭风味,最终影响产物的风味[6-8]。

本研究收集不同来源的多肽,包括大豆多肽、玉米多肽、小麦多肽、酵母多肽,使用固定的热反应模型进行反应,采用HS-SPME-GC-MS技术对热反应后的风味物质进行检测,并通过风味分析、聚类分析和主成分分析方法对检测结果进行分析。探讨不同来源的多肽反应后的风味差异、不同热反应风味的挥发性化合物组成差异以及风味物质与感官属性之间的相关性,为热反应香精的工艺探索及风味化合物形成机制研究提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大豆多肽1号、玉米多肽1号和小麦多肽1号：购于西安某公司,以下简称DD1、YM1、XM1;大豆多肽2号、玉米多肽2号：购于山东某公司,以下简称DD2、YM2;基础型酵母多肽LA00、浓厚味酵母多肽FA31以及小麦多肽2号：安琪酵母股份有限公司,以下简称YE1、YE2、XM2。

BSA124S电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司;HHM-2数显恒温水浴锅 常州易晨仪器制造有限公司;50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取吸附头 美国Supelco公司;7890B-5977B GC-MS 美国Agilent公司。

1.2 实验方法

1.2.1 不同多肽总氮和氨基酸态氮的测定

对收集的大豆多肽1号、玉米多肽1号、小麦多肽1号、大豆多肽2号、玉米多肽2号、基础型酵母多肽LA00、浓厚味酵母多肽FA31以及小麦多肽2号共8种多肽进行总氮和氨基酸态氮的检测,其中检测方法依据国标GB/T 23530—2009中总氮和氨基酸态氮的测定方法进行检测。

1.2.2 不同多肽分子量分布的测定

利用高效凝胶过滤色谱法测定酵母抽提物的寡肽分子量分布。色谱条件:色谱柱:TSK-gel G2000SWXL (300 mm×7.8 mm,5 μm);流动相:乙腈∶水∶三氟乙酸为50∶50∶0.1;检测波长:220 nm;流速:1.5 mL/min;检测时间:50 min;进样体积:20 μL;柱温:40 ℃。

1.2.3 不同多肽热反应实验

将8种多肽进行热反应,反应配方:50%的多肽样品、2%的还原糖(葡萄糖∶木糖为1∶1)、0.5%的半胱氨酸、0.5%的硫胺素;反应条件:温度100 ℃,时间60 min,pH 6。多肽混合还原糖和含硫氨基酸的模型是很多肉味香精配方配置的基础模型,因此本实验使用该模型测试不同多肽参与热反应所形成的风味。

1.2.4 多肽热反应后风味感官对比

对不同多肽反应的样品进行感官分析,邀请专业的感官小组(10人)根据表1的评分标准进行评分。

表1 多肽反应后感官评分标准

1.2.5 多肽反应后风味物质的GC-MS检测

采用顶空固相微萃取(headspace solid-phase microextraction,HS-SPME)对不同多肽热反应后样品的挥发性风味化合物进行提取和富集。称取样品1 g,加入 4 g NaCl、4 mL水。在称取好的样品中加入1 μL内标(邻二氯苯0.1 μL/mL),立即用带有硅橡胶垫的瓶盖密封,放入 GC-MS 仪器中,孵化 30 min,萃取 30 min,然后进样,解吸5 min。GC-MS 参数见表2。

表2 GC-MS 参数

表3 不同多肽热反应后主要挥发性风味物质和含量

1.2.6 数据处理方法

采用Excel软件对数据进行分析和处理。 采用JMP 10软件进行主成分分析和聚类分析,其中聚类分析采用Ward法进行分析。

2 结果与分析

2.1 不同多肽总氮和氨基酸态氮的对比

不同来源多肽的总氮和氨基酸态氮的数据见图1,可以发现西安和山东两家公司的多肽的总氮含量均为13%以上,说明多肽的含量均在80%以上,是纯度较高的多肽产品,此外,这些多肽产品的氨基酸态氮含量均很低,基本在1%～2%之间,说明该多肽产品的游离氨基酸含量均较低,可能是产品酶解后进行了透析除盐的工艺,导致一部分游离氨基酸被去除。对比安琪酵母的小麦多肽,发现其总氮含量较其他多肽厂家的产品略低,但是游离氨基酸的含量比较高。安琪酵母的YE1与XM2的总氮和氨基酸态氮含量差别不大,而YE2的总氮和游离氨基酸含量均较YE1和XM2低。

2.2 不同多肽分子量分布对比

不同来源的多肽分子量分布数据见图2,实验收集的分子量基本小于1 000 Da,同时发现两家不同公司的大豆多肽和玉米多肽的分子量分布基本一致,可能使用了类似的蛋白酶和条件进行酶解;XM2和YE1具有较高比例(≤180 Da)的肽,主要为游离氨基酸,此结果与氨基酸态氮的检测结果相符合。

图2 不同多肽分子量分布对比

2.3 多肽热反应后风味感官对比

对不同多肽热反应后的风味进行感官评分(见图3),得分最高的是YE2,其反应的风味具有较好的肉香风味,无其他异味,并且有烤香风味;其次是XM2和YE1,其中XM2同样具有相似的烤香风味但肉味相比YE2不足,YE1肉味一般,略带硫味,带有焦香味;其他植物多肽均出现明显的硫味和酸味,肉味较不明显。

图3 不同多肽热反应风味感官评分

2.4 多肽反应后GC-MS分析

不同多肽热反应后的风味物质组成见图4。

图4 不同多肽热反应风味成分分析结果

反应后的风味物质主要由吡嗪类、酸类、醛类、醇类、呋喃类、含硫化合物和其他类组成。从挥发物含量可以发现XM2与YE1的含量较高,这与其游离氨基酸含量较多相关,说明游离氨基酸含量越高,其形成的风味越强。吡嗪类化合物主要是游离氨基酸、寡肽与还原糖通过美拉德反应生产的一类具有烤香、土豆香等特征香气的化合物,对热反应后样品的风味具有较大的贡献[9-10];呋喃类化合物是带有焦糖和甜味的一类化合物;含硫化合物如2-甲基-3-呋喃硫醇、双(2-甲基-3-呋喃基)二硫醚、噻唑类化合物具有明显的肉类风味,主要是含硫氨基酸如半胱氨酸、硫胺素通过热反应产生,一般含硫化合物的阈值较低,当含量较高时会出现明显的硫磺臭味,影响反应样品的整体风味[11-12]。多肽反应后的样品,由于不同风味物质含量不同,导致最终的风味呈现明显的差异,YE2含有较高的吡嗪含量、相对较低的含硫化合物含量和极低的酸类含量,因此其风味较好,有较好的烤香风味;YE1与XM2的吡嗪含量中等,酸类和含硫化合物含量较高,因此具有一定的肉香风味,但是略有硫味;其他植物多肽的吡嗪含量较低,酸类和含硫化合物含量较高,因此导致风味较差,呈现酸味和硫味。因此可以发现吡嗪类化合物能够掩盖含硫化合物和酸类的异味,并且提供丰富的烤香、可可、咖啡等风味。

2.5 多肽热反应后风味物质聚类分析

对不同多肽热反应后的风味物质进行聚类分析,其聚类分析的结果见图5。

图5 多肽热反应后风味物质Ward法聚类分析

从分析结果中可以发现,8种多肽反应后的风味可以分为两大类,其中山东和西安两家公司的多肽类反应风味,DD1、DD2、YM1、YM2和XM1为一类,YE1、YE2以及XM2为一类。进一步分类可以看到多肽类的产品反应风味分为3种,分别是大豆多肽类、玉米多肽类和小麦多肽类;而YE1、YE2以及XM2分为两类,YE1自成一类,YE2与XM2为一类。

2.6 多肽热反应后风味物质主成分分析

采用主成分分析方法对多肽热反应后挥发性风味物质的成分进行分析,从而反应出不同多肽热反应后挥发性风味组成差异。经主成分分析得到的特征值和特征向量见表4,可以得到前4个主成分(特征值>1)的累计贡献率达到82%,能够较好地反映样品的整体信息。

表4 主成分的特征值和贡献率

风味物质主成分分析载荷图见图6。

图6 多肽热反应后风味物质主成分分析载荷图

由图6可知,基本所有的吡嗪类化合物均在PC1的正坐标处,说明吡嗪类化合物对PC1具有正相关;同样大部分的呋喃化合物和含硫化合物也处于PC1的正坐标处,因此PC1也与呋喃化合物和含硫化合物呈正相关;而酸类、醛类、醇类化合物处于PC1的负坐标处,说明其与PC1呈负相关。同理,对PC2进行分析发现,吡嗪类化合物同样处于PC2的正坐标处,而呋喃化合物和含硫化合物处于PC2的负坐标处,因此PC2与吡嗪类化合物呈正相关,与呋喃类化合物和含硫化合物呈负相关;大部分酸类、醛类、醇类化合物处于PC2坐标±0.5之间,说明对PC2的影响较小。此外,PC3分析显示化合物在PC3坐标上分布较杂乱,且PC3的贡献率相对PC1和PC2较小,因此其与多肽热反应后风味化合物的类别无明显的规律。

根据风味物原始数据的标准化矩阵、前两个主成分的特征值和因子载荷矩阵,计算得到多肽热反应样品第一、第二主成分得分,以第一主成分为横坐标、第二主成分为纵坐标,将样本投影到该坐标系上,作出主成分二维得分,见图7。

图7 多肽热反应后风味物质主成分散点图

由图7可知,DD1、DD2、YM1、YM2和XM1分布接近,处于PC1负坐标和PC2中轴处,说明其主要贡献的风味物质成分类似,因此风味也较接近;YE2和XM2同处于第一象限,说明风味类似;而YE1独处于第四象限,因此风味与其他多肽有一定的差距。此方法分析的结论与聚类分析的分类结果基本一致。结合图6进行分析,DD1、DD2、YM1、YM2和XM1在散点图中的分布匹配风味物质载荷图,可以发现其主要的特征风味化合物为酸类、醛类和醇类化合物;YE2和XM2同处于第一象限,说明其特征风味物质主要为吡嗪类化合物,且YE2比XM2更远离轴心位置,说明其吡嗪类化合物对YE2的风味贡献比XM2更大;YE1自成一类,在第四象限,主要对应的大部分为呋喃化合物和含硫化合物,还包括少量酸类化合物乙酸等。

3 结论

本研究采用HS-SPME结合GC-MS对不同多肽热反应后形成的风味物质进行定量测定,并通过风味成分分析、聚类分析和主成分分析对测定结果进一步分析。不同的多肽热反应后风味差距较大,其中植物多肽大豆多肽1号、2号,玉米多肽1号、2号以及小麦多肽1号热反应后主要风味物质以含硫化合物和酸类较多,因此为硫味和酸味,肉味较弱;浓厚味酵母抽提物和小麦多肽2号吡嗪类化合物较多,因此呈现烤香味,但是浓厚味酵母抽提物吡嗪含量更多,因此整体风味更好;基础型酵母抽提物反应后各风味物质较均衡,含硫和酸味化合物也较多,因此风味也呈现肉风味,但是略带硫味。聚类分析和主成分分析显示植物多肽大豆多肽1号、2号,玉米多肽1号、2号以及小麦多肽1号为一类,特征化合物为酸类、醛类和醇类化合物;浓厚味酵母抽提物和小麦多肽2号为一类,特征化合物为吡嗪类化合物;基础型酵母抽提物自成一类,特征化合物大部分为呋喃化合物和含硫化合物,还包括少量酸类化合物乙酸等。

对比总氮和氨基酸态氮的检测数据,发现其热反应的风味与总氮含量的高低并无明显关系,与氨基酸态氮有一定的关联,即与游离氨基酸含量相关,这是因为不同氨基酸发生美拉德反应形成多种吡嗪类化合物。其中浓厚味酵母抽提物游离氨基酸含量并不如基础型酵母抽提物,但是其吡嗪类化合物的种类和含量明显高于基础型,可能与浓厚型酵母抽提物含有丰富的浓厚味寡肽有关。结合整体的风味来看,热反应中较高的含硫化合物和酸类含量不利于良好风味的形成,而吡嗪类化合物能够掩盖含硫化合物和酸类的异味,并且提供丰富的烤香、可可、咖啡等风味,合适的吡嗪类化合物和含硫化合物比例可以搭配出较好的烤肉风味。

综上所述,不同来源的多肽使用相同模型热反应出的风味有较大差异,通过聚类分析和主成分分析可以有效地进行分类和区别,鉴别其对风味影响的关键化合物类别,初步探讨热反应烤肉风味形成规律,为之后多肽应用于热反应风味的研究提供理论依据。