大孔树脂富集丹参中丹酚酸B的工艺过程分析研究*

毕 赟 徐正圆 薛思敏 董静怡 宋精梅 张宇燕

（浙江中医药大学，浙江 杭州 310053）

丹参是唇形科植物丹参SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根和根茎，具有活血祛瘀、通经止痛、清心除烦、凉血消痈等功效，是临床和中药新药开发的常用中药。丹参中丹酚酸B 含量较高，是丹参的主要有效水溶性成分［1］，活性较强，对心脑血管系统、肝脏、肾脏、肺都有保护作用，具有清除氧自由基、抗氧化、抗炎、抗纤维化等药理作用，对调控心血管疾病有重要作用［2-3］。

大孔吸附树脂是一种不溶于酸、碱及各种有机溶剂的高分子聚合物。在中药现代化研究中，应用大孔树脂分离富集中药有效成分及中药复方有效部位已越来越受到重视［4-7］。大孔吸附树脂既可除去一些杂质以提高有效部位的纯度，又可确保中药制剂的稳定性和均一性。但因中药及复方成分多且复杂，大孔树脂对不同成分的吸附选择性不同，使得复方药效物质基础的保留率相差也较大［8］。

本实验采用常规制剂工艺提取采用的醇提法回流提取丹酚酸B，优化其提取工艺，采用大孔树脂吸附法纯化丹参提取液中的丹酚酸B，考察吸附洗脱过程中多个影响因素对纯化效果的影响，分析其吸附原理。优化、分析后得到的提取纯化工艺可为含有丹参的复方及丹酚酸B 的制剂的优化开发研究提供参考，可为进一步推进大孔吸附树脂优化中药复方及制剂工艺开发的研究，奠定较好的实验和理论基础。

1 材 料

紫外可见分光光度计（UV-2800/2802/2802S，上海恒科仪器有限公司）；电子天平（XS205，梅特勒-托利多仪器有限公司）。丹参（四川省中药饮片有限责任公司，批号：200401）；丹酚酸B 对照品（上海源叶生物科技有限公司，批号：BJ0405QA18）；D201、D101、AB-8 大孔树脂（天津市海光化工有限公司）；其余均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 建立丹酚酸B的含量测定方法

2.1.1 对照品溶液的制备 丹酚酸B 干燥至恒重，精密称取5.0 mg，70%乙醇溶解并定容至10 mL，作为对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备 称取丹参5 g，加8 倍体积的70%乙醇提取，过滤，滤液定容至100 mL，作为供试品溶液。

2.1.3 丹酚酸B 标准曲线的绘制 准确吸取不同体积的对照品溶液，制备成梯度浓度在287 nm 测定吸光度，计算得丹酚酸B标准曲线方程Y=0.021 6X-0.006 9（R=0.999 6）。

2.1.4 精密度试验 取同一浓度对照品溶液，按照标准曲线绘制方法测定5 次，计算测得吸光度的相对标准偏差RSD=1.6%，表明丹酚酸B的精密度良好。

2.1.5 稳定性试验 取同一浓度对照品溶液，分别在时间点0、2、4、6、8 h 测定吸光度，计算RSD=1.5%，表明丹酚酸B在8 h内稳定性较好。

2.1.6 重复性试验 按照供试品溶液的制备方法同步实验5 次，测定吸光度，计算丹酚酸B 浓度的RSD=3.7%。

2.1.7 加样回收试验 称取5 份相同质量的丹参，加入等量的丹酚酸B，按照供试品溶液的制备方法同步实验6 次，测定吸光度，计算丹酚酸B 含量的平均回收率为104.72%，相对标准偏差RSD=4.41%。

2.2 丹酚酸B提取工艺的优化研究

采用L9（34）正交设计试验优化提取工艺，分别考察影响丹酚酸B 提取得率的因素：提取次数、提取时间、乙醇浓度，按供试品溶液的制备方法，以丹酚酸B为指标，分析以上因素对丹酚酸B 提取工艺的影响。因素水平见表1，实验结果见表2，统计分析见表3。结果表明3 个因素对丹酚酸B 提取的影响程度大小顺序为C＞A＞B，最佳工艺条件为A3B2C1（即70%乙醇，回流2 h，提取1 次）。按照此最佳工艺条件，按照供试品溶液的制备方法重复实验3 次，得到丹酚酸B 的平均含量为107.12 mg/5 g。

表1 丹酚酸B提取因素水平表

表2 丹酚酸B的正交试验结果

表3 丹酚酸B正交方差分析

2.3 大孔树脂纯化丹酚酸B的工艺研究

2.3.1 样品溶液的制备 丹参以70%的乙醇为溶剂，溶剂量为药材体积的8 倍，回流2 h，提取1 次，测定丹酚酸B 含量为0.21 mg/mL。回收乙醇，用水溶解定容至等体积，作为上样液。

2.3.2 大孔树脂型号的选择 取经预处理后的D201、D101、AB-8 型大孔吸附树脂各10 mL，湿法装柱。以1BV/h流速上样，上样结束后6 h静置，用10 BV的70%的乙醇进行洗脱，测定计算洗脱液中丹酚酸B 的含量及其转移率，重复3 次（转移率=洗脱液中丹酚酸B 的含量÷样品溶液中丹酚酸B 含量）结果见表4。本实验选用D101型继续开展优化研究。

表4 不同型号大孔吸附树脂纯化后丹酚酸B的转移率（%）

2.3.3 上样流速的优化研究 取预处理后的D101 型大孔吸附树脂各5 mL，取丹参溶液各25 mL 以1、2、3、4、5 BV/h的流速上样，上样结束后6 h静置。测定计算吸附后的溶液中丹酚酸B的含量及其转移率。结果见图1，最佳吸附流速为1 BV/h，随流速增加，丹酚酸B的吸附效果明显下降，5 BV/h有所回升。

图1 上样吸附流速对吸附的影响

2.3.4 静态吸附时间的优化研究 按照最佳上样浓度上样后，分别观察在吸附时间1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 h 后的溶液中丹酚酸B 的含量及其转移率。结果见图2，最佳吸附时间为6 h。

图2 上样吸附时间对吸附的影响

2.3.5 上样溶液pH 值的优化研究 将优化后上样液分别调pH值为3、4、5、6、7，吸附6 h后测得丹酚酸B的含量及其转移率，结果见图3，最佳上样样品pH值为4。

图3 上样液pH值对吸附的影响

2.3.6 洗脱流速对解吸率的影响 将吸附饱和的大孔吸附树脂各5 mL，先用蒸馏水洗涤，30%乙醇溶液100 mL除去悬浮物和杂质等，再用70%乙醇溶液100 mL进行洗脱，分别以1、2、3、4、5 BV/h 流速进行洗脱，取样测定计算洗脱溶液中丹酚酸B的含量，再计算其转移率。结果见图4，最佳洗脱流速为1 BV/h。

图4 洗脱流速对解吸率的影响

2.3.7 洗脱剂浓度对解吸率的影响 将吸附饱和的大孔吸附树脂各5 mL，用蒸馏水洗涤，再用浓度为10%、30%、50%、70%、90%的乙醇溶液每种100 mL 以1 BV/h 的流速进行洗脱，测定计算丹酚酸B 的解吸率，结果见图5，最佳洗脱乙醇浓度为70%。

图5 洗脱浓度对解吸率的影响

2.3.8 大孔树脂纯化工艺的验证 按照以上吸附、洗脱条件的优化结果，即上样液pH 值为4，上样流速为1 BV/h，吸附6 h，70%乙醇为洗脱剂，以1 BV/h 速度洗脱，洗脱液定容测定丹酚酸B的含量并计算其得率，结果得率为56.8%。

2.4 大孔树脂吸附丹酚酸B的动力学分析

2.4.1 吸附动力学实验 取预处理好的大孔树脂10 mL装入50 mL 锥形瓶中，加20 mL 样品溶液在35 ℃的摇床振荡器中，以100 r/min 的振速振荡吸附，分别在2、5、10、15、20、30、40、60、90、120、180、300 min 收集溶液，测量并计算丹酚酸B 的含量，见表5。以吸附量为纵坐标，时间为横坐标绘制吸附曲线，见图6。

图6 大孔树脂吸附丹酚酸B的动力学过程

表5 大孔树脂吸附丹酚酸B的动力学实验结果

吸附量的计算公式：Qt=（C0-Ct）V/vM。

Qt为即时吸附量，Co为样品溶液起始质量浓度，V为样品溶液体积，v 为树脂体积，M 为对照品丹酚酸B的摩尔质量，Ct为即时的溶液质量浓度。

2.4.2 吸附动力学方程拟合 运用准一级和准二级速率方程来拟合大孔树脂对丹参溶液的吸附过程，再用Weber and Morris 颗粒内扩散方程对扩散机理进行分析［8］。采用以下方程对动力学过程的实验结果进行拟合，分析大孔树脂吸附丹酚酸B 的吸附过程。使用origin软件对实验结果进行分析，结果见表6。

表6 动力学模型拟合方程及模型参数

1）Lagergren 准一级速率方程：主要适用于固体-液体吸附体系的模型。

公式：ln（Q1-Qt）=lnQ1-K1t。

F 代表t时刻的吸附分数，Q1为一级吸附平衡时的吸附量，K1为一级速率常数。

以ln（Q1-Qt）对t 进行线性回归，若R2＞0.9，可表明薄膜扩散是控制该吸附的因素。

2）准二级速率动力学方程。

公式：t/Qt=1/（K2×Q22）+tQ2。

Q2为二级吸附平衡时的吸附量，其中K2为二级速率常数。若R2＞0.9，可表明颗粒内扩散是控制该吸附过程的因素。

3）颗粒内扩散模型：Webber and Morris 等采用颗粒内扩散模型对吸附过程进行描述。

其中，K3为树脂颗粒内扩散速率常数，C 为任意常数。以Qt对进行线性回归，对实验数据进行拟合，如果结果是过原点的一条直线，那么表明该吸附过程只受到一个过程影响，如果拟合结果为不经过原点的分段式曲线，那么表明这个过程受到两种或多种扩散过程共同影响。

结果显示准一级速率方程拟合中R2=0.97，准二级速率方程拟合中R2=0.99，表明该吸附过程采用准二级速率方程能更好拟合，准二级速率方程能更好描述该吸附过程。

本实验中Webber and Morris 方程拟合得到的直线未过原点，说明吸附过程受到薄膜扩散和内扩散的共同影响，根据实验结果的拟合曲线分成了2 段，第1 阶段为薄膜扩散，第2 阶段为内扩散，两阶段中的速率常数K3对比，第1阶段的速率常数大得多，表明薄膜扩散为主要速率控制步骤。

3 讨 论

丹参中丹酚酸B 具有组织修复及脑神经保护、促进记忆等作用［9-16］。传统的中药配伍提取常用溶剂为大量的水，丹酚酸B为水溶性成分，具有较重要的药理活性，常作为质量标准指标之一［17-19］。中药中分离纯化技术，对中医药现代化进程的研究，包括制剂开发和中医药理论的现代阐述，具有重要的意义。中药研究需要分离纯化化学成分，也需要分离分析中药产生药效的科学理论依据，因此对丹参等中药材开展分离分析的动力学原理研究非常有必要。

大孔吸附树脂不仅理化性质稳定、选择性好、吸附能力强，而且易洗脱、可循环使用，再生处理经济环保，处理后能减小服用剂量和降低制剂的吸潮性、方便制剂成型，提高制剂稳定性等，已广泛应用于中药及其复方中活性成分的精制分离、去除有害杂质，得到了工业化推广应用。由于中药成分复杂多样，各成分间的理化性质差别大，提取分离纯化过程中也存在相互影响，导致动力学过程千变万化，不同型号的大孔树脂对同一成分的吸附性能不同，同一型号对不同成分吸附也不同，而且很难用一种树脂对所有的中药活性成分进行分离纯化。大量研究表明，树脂的型号、质量、安全性、稳定性及再生性方面还存在一些具体的技术问题，树脂的吸附及洗脱工艺受多种因素影响，在工业化实际应用中需通过对每个成分或有效部位的优化研究确定最佳条件，才能符合工业化生成需要，同时不影响临床疗效。

本实验通过正交设计优化丹参中丹酚酸B 的提取工艺，分析乙醇浓度、回流时间、回流次数等因素对丹酚酸B 提取过程的影响，得到最佳工艺条件：70%乙醇提取2 h，提取1 次。在此基础上，通过吸附效果评价转移率，筛选出D101型大孔吸附树脂开展纯化工艺研究，单因素考察上样流速、静态吸附时间、上样溶液pH值、洗脱剂浓度、洗脱流速等因素的影响，优化最佳纯化工艺条件为：上样液pH 值为4，上样流速为1 BV/h，吸附6 h，70%乙醇为洗脱剂，以1 BV/h 速度洗脱。大孔树脂吸附丹酚酸B 动力学研究实验结果表明，准二级速率方程能更好描述D101 型大孔吸附树脂对丹酚酸B 的吸附过程，并且此过程受到薄膜扩散和内扩散的共同影响，且主要速率影响因素为薄膜扩散运动。本实验优化得到的丹酚酸B 提取纯化工艺条件，可为含有丹参的复方及丹酚酸B的制剂的优化开发研究提供依据，对吸附过程的动力学分析也有助于为中药材的工业化、临床配伍及中医药现代化研究提供参考。