益气活血生肌方对肛瘘术后急性感染性创面模型大鼠Vimentin、TNF-α和IL-4表达水平的影响*

张飞功 李犹龙 严 桦

（上海市静安区闸北中心医院，上海 200070）

肛瘘是因细菌感染肛门腺体及肛隐窝所导致的肛门部疾病，在临床上属于常见病、多发病［1］。肛瘘由于发病部位特殊，不易保持创面的清洁干燥，加之术后对肛缘皮肤黏膜的损伤，且伴随着局部组织的坏死和渗出，使创面易于感染，导致病程较长［2-3］。中医学中肛瘘术后创面感染属“溃疡”范畴，其病机为瘀血阻络，气血不通，失于濡养，导致创面水肿等，创面愈合缓慢，以益气活血生肌为治法［4］。益气活血生肌方具有清热解毒、活血止痛、敛疮生肌的作用，可达到缓解术后疼痛、水肿等并发症，促进创面向愈的目的［5］。皮形蛋白（Vimentin）属中间丝蛋白类，在中胚层起源的细胞中表达，如成纤维细胞、内皮细胞和白细胞等，其高表达可促进疾病的发展［6］。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）可提高中性粒细胞的吞噬能力，促进中性粒细胞黏附到内皮细胞，刺激机体局部炎症反应［7］。白细胞介素-4（IL-4）是一种重要的炎症因子，具有活化B 细胞、刺激T 细胞增殖并参与炎症反应等功能，从而加重肛瘘创面，延缓愈合［8］。为此，本研究探讨益气活血生肌方对肛瘘术后急性感染性创面模型大鼠Vimentin、TNF-α、IL-4表达水平的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级雄性SD大鼠112只购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物生产许可证号：SCXK（湘）2020-0005，饲养于医院实验中心，体重280～340 g。于清洁动物实验室饲养，操作过程符合动物伦理要求，动物饲养温度20～28 ℃，相对湿度50%～60%，通风良好，环境安静，实验期间自由进食饮水，每日黑暗和光照各12 h。

1.2 试药与仪器

益气活血生肌方（黄芪20 g，太子参15 g，白术15 g，淮山药15 g，当归20 g，熟地黄10 g，丹参25 g，川芎15 g，薏苡仁20 g，茯苓10 g，甘草6 g）由医院制剂室制备，水煎煮，合并2次滤液，定容至20 mL，每毫升相当于0.4 g生药。湿润烧伤膏，汕头市美宝制药公司；1%戊巴比妥钠，上海上药新亚药业公司。酶标仪，日本Bio-Rad公司；台式离心机，上海安亭科学仪器厂；酶联免疫检测试剂盒，上海酶联科研公司；隔水式恒温培养箱，山东博科公司。Vimentin 蛋白单抗由上海易利生物科技公司，货号：BLL101178E，批号：201911016。TNF-α检测试剂盒，南京建成生物公司，货号：ml002859，批号：201909023。IL-4 检测试剂盒，信裕生物公司，货号：xy-E10165，批号：201907028。

1.3 模型制备［9］

大鼠造模前禁水、禁食6 h，术前在脊柱两侧手术部位备皮，1%戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉。术区常规备皮、消毒，大鼠脊柱尾部的一侧剪1 个约为2.0 cm×2.0 cm 大小的全层皮肤创面，切除皮肤全层深达肌层，并充分止血。空白组大鼠创面滴加0.2 mL 的生理盐水，然后用油纱辅料覆盖。实验组、对照组大鼠皮肤创面分别滴加制备好的粪便混悬液1.0 mL，再加盖医用纱布包扎处理，之后把大鼠放回笼中等待麻醉苏醒。每天两组按同样的步骤操作1 次，约5 d 后，如果有脓性分泌物，则表示伤口已发生急性感染。造模成功后，为防止相互舔舐及撕咬影响创面，每只大鼠单独饲养。

1.4 分组与治疗

将造模后的112 只大鼠按照随机数字表法均分为4 组，分别为空白组、模型组、湿润烧伤膏组和益气活血生肌方组，每组28 只。各组大鼠均采用创面络合碘消毒，生理盐水冲洗创面。空白组：早晚用生理盐水棉球清创后以无菌纱布覆盖固定，并涂抹0.2 g 的凡士林膏。模型组：每日早晚用生理盐水棉球清创并予以无菌纱布覆盖固定。湿润烧伤膏组：用湿润烧伤膏油纱条覆盖创面，再盖无菌纱布固定，每日早晚换药各1次，治疗2 周。益气活血生肌方组：用湿润烧伤膏油纱条覆盖创面，再盖无菌纱布固定。按照成人体重70 kg为标准，换为大鼠所需剂量（g/kg）=成人所需药量（g/kg）×6.3，再根据每100 g灌胃1 mL的标准计算，每只大鼠每天以3 mL 益气活血生肌方汤药灌胃治疗，每日早晚换药及灌胃各1次。各组均连续治疗两周。

1.5 观察指标

1.5.1 创面愈合率 治疗3、7、14 d后对创面面积进行测定：固定大鼠，创面周围毛发进行修剪，将保鲜膜平铺于充分暴露的创面上，用细中性记号笔在保鲜膜上画创面标记，再将标记好的保鲜膜平铺在心电图纸张上，并对创面进行面积计算，最终算出愈合率。创面愈合率=（原创面面积-未愈合创面面积）÷原创面面积×100%。

1.5.2 肛瘘创面分泌物及水肿评分 治疗后3、7、14 d对大鼠的肛瘘创面水肿评分进行测定：0 分为创面无水肿；1 分为创面少量分泌物，轻度水肿；2 分为创面中度水肿；3 分为创面分泌物较多，重度水肿。分值数越高表示创面分泌物与创面水肿越严重。

1.5.3 肛瘘创面肉芽生长评分 治疗后3、7、14 d，对大鼠的肛瘘创面肉芽生长情况测定：0 分指肉芽红润颗粒状，轻擦出血；1 分指肉芽色淡红均匀，轻擦出血；2 分指肉芽色苍白凹凸，擦之不出血；3 分指肉芽色晦暗，局部无肉芽，擦之不出血。分值数越高表示创面肉芽生长越差。

1.5.4 创面组织IL-4、TNF-α 表达水平 采用无菌刮勺于大鼠肛瘘创面上刮取1 g 的新鲜全层组织，-60 ℃保存。使用低温匀浆器中放入0.3 g 组织，制成组织匀浆液，加入裂解液（PIRA）950 μL，再向匀浆液中加苯甲基硫酰氟溶液35 μL进行摇匀，20 min后4 ℃、12 000 r/min离心10 min后留取上清液。应用酶联免疫吸附法（ELISA）进行检测，对IL-4、TNF-α 表达水平测定，并严格遵守试剂盒（默赛飞公司）说明书操作。

1.5.5 Vimentin 蛋白检测 采用蛋白免疫印迹法（WB）检测Vimentin蛋白表达，分别在给药后3、7、14 d，无菌条件下取创面中心至创缘间刮取新生肉芽组织，加入1 mL 的细胞裂解液，抽提各组组织中的总蛋白，并采用BCA 法测定蛋白浓度，取蛋白样品SDS-PAGE凝胶电泳，然后全部转移到PVDF 膜上，加入5%脱脂奶粉封闭液，室温封闭1～2 h。吸弃封闭液，TBST 洗膜3 次，加入用5%脱脂奶粉配制好的一抗工作液兔抗人Vimentin（1∶500），摇床上孵育1 h，4 ℃孵育过夜。回收一抗，用TBST 洗膜3 次，加入羊抗兔二抗工作液（1∶5 000），室温孵育1～2 h。洗膜，放入自动显影仪中曝光显影，用Image J 软件测出各组Vimentin 蛋白灰度值。

1.6 统计学处理

2 结 果

2.1 各组大鼠肛瘘创面愈合率比较

见表1。治疗3 d 后，各组的创面愈合率对比差异无统计学意义（P＞0.05），治疗7、14 d 后，湿润烧伤膏组和益气活血生肌方组的创面愈合率明显高于空白组（P＜0.05），益气活血生肌方组的创面愈合率明显高于湿润烧伤膏组（P＜0.05）。

表1 各组大鼠肛瘘创面治疗愈合率比较（%，±s）

表1 各组大鼠肛瘘创面治疗愈合率比较（%，±s）

注：与空白组比较，*P ＜0.05；与模型组比较，#P ＜0.05；与湿润烧伤膏组比较，△P ＜0.05。下同。

组 别空白组模型组湿润烧伤膏组益气活血生肌方组n7 7 7 7治疗3 d 9.18±2.94 8.94±2.97 10.24±2.53 10.67±2.83治疗7 d 37.53±4.61 24.39±6.78*54.29±5.29*#65.73±5.47*#△治疗14 d 67.39±4.15 42.57±4.87*74.61±4.76*#97.9±5.43*#△

2.2 各组大鼠肛瘘创面分泌物及水肿评分、创面肉芽生长评分比较

见表2、表3。治疗3 d 后，各组的大鼠肛瘘创面分泌物及水肿评分、创面肉芽评分对比无明显差异（P＞0.05），治疗7、14 d 后，湿润烧伤膏组和益气活血生肌方组的大鼠肛瘘创面分泌物及水肿评分、创面肉芽评分明显低于空白组（P＜0.05），益气活血生肌方组的大鼠肛瘘创面分泌物及水肿评分、创面肉芽评分明显低于湿润烧伤膏组（P＜0.05）。

表2 各组大鼠肛瘘创面分泌物及水肿评分比较（分，±s）

表2 各组大鼠肛瘘创面分泌物及水肿评分比较（分，±s）

组 别空白组模型组湿润烧伤膏组益气活血生肌方组n7 7 7 7治疗3 d 2.61±0.18 2.63±0.22 2.57±0.18 2.46±0.20治疗7 d 2.03±0.26 2.35±0.37*1.98±0.26*#1.17±0.18*#△治疗14 d 1.62±0.23 1.97±0.29*1.28±0.32*#0.70±0.12*#△

表3 各组大鼠肛瘘创面肉芽生长评分比较（分，±s）

表3 各组大鼠肛瘘创面肉芽生长评分比较（分，±s）

组 别空白组模型组湿润烧伤膏组益气活血生肌方组n7 7 7 7治疗3 d 2.41±0.40 2.43±0.43 2.39±0.45 2.31±0.44治疗7 d 1.75±0.36 2.03±0.44*1.41±0.28*#1.15±0.19*#△治疗14 d 1.46±0.31 1.64±0.38*0.98±0.45*#0.57±0.16*#△

2.3 各组大鼠肛瘘创面血清炎性因子水平比较

见表4。治疗3 d 后，各组大鼠创面TNF-α、IL-4水平对比差异无统计学意义（P＞0.05），治疗7、14 d后，湿润烧伤膏组和益气活血生肌方组创面TNF-α、IL-4水平明显低于空白组与模型组（P＜0.05），益气活血生肌方组的创面TNF-α、IL-4 水平显著低于湿润烧伤膏组（P＜0.05）。

表4 各组大鼠肛瘘创面TNF-α、IL-4水平比较（ng/L，±s）

表4 各组大鼠肛瘘创面TNF-α、IL-4水平比较（ng/L，±s）

IL-4 TNF-α组别空白组模型组湿润烧伤膏组益气活血生肌方组n7 7 7 7治疗3 d 77.63±12.41 79.29±12.70*75.26±10.42*#74.96±11.23*#△治疗7 d 72.61±8.12 76.84±7.49*63.19±6.42*#50.64±5.61*#△治疗14 d 51.34±4.08 52.18±5.41*47.52±3.35*#38.24±3.12*#△治疗3 d 59.28±8.07 60.13±8.11*56.12±6.75*#55.98±7.24*#△治疗7 d 52.40±6.88 50.78±7.27*48.17±5.30*#39.22±4.51*#△治疗14 d 44.62±5.03 46.28±5.17*37.26±4.22*#25.38±3.18*#△

2.4 各组肛瘘创面Vimentin蛋白表达水平比较

见表5。治疗3 d后，各组的大鼠肛瘘创面Vimentin蛋白表达对比无明显差异（P＞0.05），治疗后7、14 d，湿润烧伤膏组和益气活血生肌方组的大鼠肛瘘创面Vimentin 蛋白表达明显低于空白组（P＜0.05），益气活血生肌方组的大鼠肛瘘创面Vimentin蛋白表达显著低于湿润烧伤膏组（P＜0.05）。

表5 各组大鼠肛瘘创面Vimentin蛋白表达水平比较（±s）

表5 各组大鼠肛瘘创面Vimentin蛋白表达水平比较（±s）

组 别空白组模型组湿润烧伤膏组益气活血生肌方组n7 7 7 7治疗3 d 1.96±0.23 2.03±0.24 1.98±0.21 1.91±0.31治疗7 d 1.69±0.21 1.86±0.27*1.44±0.19*#1.19±0.15*#△治疗14 d 1.39±0.17 1.57±0.22*1.21±0.11*#0.78±0.09*#△

3 讨 论

肛瘘是结直肠肛门外科的常见疾病，其主要治疗手段为手术根治，可彻底排净病灶脓液、减低疾病复发率，但为保证病灶的清除，往往造成创缘皮肤缺损，是肛瘘创面难愈合的重要原因［10］。此外，病灶位于消化道末端，粪便反复排出，且局部潮湿，得不到及时的处理，易致大量细菌聚集，诱发Vimentin 蛋白表达升高，引起炎症等反应［11］。肛瘘术后创面受炎症和外界因素的影响，易导致肉芽水肿、腐肉滋生、愈合时间延长等情况，此时，创面损伤区浸润大量炎性细胞（IL-4、TNF-α）反应，也是造成肛瘘术后康复缓慢的重要原因［12］。术后早期干预创面的生长环境，减少组织坏死、减轻炎症反应、加快腐肉脱落是有效促进肉芽组织重塑、肛瘘创面愈合的途径［13］。因此，寻找有效促进肛瘘术后创面愈合的药物，成为缩短肛瘘病程、减轻痛苦的有效办法［14］。湿润烧伤膏是一种油性药膏，可在创面形成保护膜，避免神经末梢受到外界因素刺激，其不足之处在于揭去药膏纱布时，可牵扯创面使刚刚愈合的创面再度撕裂，延长愈合过程。鉴于上述不足，本研究中加用益气活血生肌方，以促进创面湿润、有效改善创面微循环、加快创面恢复［15］。

中医学认为肛瘘术后创面属于金刃所伤的范畴，在肛瘘手术过程中，虽然去除了病灶的病变组织，但同时也会损伤到部分正常组织，从而使得机体气血经络受阻，血液瘀滞，创面局部的营养血供受到影响，因而也导致了创面愈合缓慢［16］。由此可知，肛瘘术后创面长期不愈合，可以辨证为气滞血瘀、气血亏虚证，因此我们制定了益气活血生肌方［17］。本方采用益气活血法为原则，健脾益气、活血养血，使整个机体和局部的气血及脉道调和通畅，即所谓“通则不痛”“荣则不痛”，从而缓解创面分泌物及水肿等并发症，使肛瘘创面加快愈合［18］。本研究结果显示，各组大鼠肛瘘创面治疗7、14 d 后，益气活血生肌方组的大鼠创面愈合率、创面分泌物及水肿评分均优于其他组，治疗效果较好。说明益气活血生肌方中药治疗具有增加创面微循环、加大毛细血管扩张、有效降低创面水肿、保持创面湿润的作用。

现代药理研究表明，益气活血生肌方可使创面的微血管循环加快，进而使得肛瘘术后创面上的新生肉芽组织加快生长，有利于促进创面恢复［19］。其方中黄芪可抑制体内的自由基，可提高黏膜的免疫能力，对细菌起到抑制作用；太子参具有抗炎、抗菌的作用；白术可清除机体内自由基、调节免疫力，还可抑制炎症、有抑菌的能力；山药中的山药多糖能增强免疫力，具有镇痛、抗炎、抗刺激的作用；当归可增加创面造血微环境的刺激，加速创面造血细胞的产生；熟地黄能够抗炎、改善局部微循环；丹参能够改善机体的微循环，具有镇静、镇痛的功效；川芎可增加创面组织的周围血管血流量，起到活血的作用；薏苡仁、茯苓可利水渗湿、排脓；甘草中和药性，增强镇痛、抗炎的作用［20］。本研究结果显示，各组大鼠肛瘘创面治疗7、14 d后，益气活血生肌方组的大鼠创面中IL-4、TNF-α 表达水平低于其他组，其治疗效果较优。说明治疗肛瘘急性感染创面采用益气活血生肌方治疗，可抑制病原微生物生长，减轻炎症反应，使生长因子聚集，促进创面愈合。

综上所述，益气活血生肌方治疗肛瘘急性感染效果确切，可促进肛瘘术后创面愈合，减轻创面分泌物及水肿情况，改善创面Vimentin蛋白含量，降低创面组织中炎症因子TNF-α、IL-4 水平表达，提高机体抗肛瘘感染的能力。