麻杏解毒合剂通过p38MAPK/AP-1通路对冠状病毒肺炎模型小鼠炎性因子的调控作用研究*

邱 敏 刘 莉 江飞龙 朱 青 陈 欢

（1.重庆市中医院，重庆 400021；2.重庆医科大学，重庆 401331；3.重庆中医药学院，重庆 402760）

病毒性肺炎是由病毒感染并蔓延引起肺实质炎症的呼吸道传染病。近20年来，由SARS冠状病毒、中东呼吸综合征冠状病毒、新型冠状病毒感染引发的病毒性肺炎在世界范围内多次暴发流行，给人们的生命安全带来了极大的威胁与伤害［1-2］。在新发突发呼吸道传染病的救治过程中，中医药发挥了重要作用。作者所在中医专家组拟定麻杏宣肺解毒汤治疗COVID-19患者，对快速改善患者发热、咳嗽、胸闷症状，减少重症转化取得较好临床疗效［3］。该协定处方经重庆市药品监督管理局批准制成院内制剂——麻杏解毒合剂［4］，用于COVID-19 患者的临床治疗。为进一步阐明麻杏宣肺合剂治疗冠状病毒肺炎，有效防治重症化转化的疗效机制，本实验建立了基于人血管紧张素-2（hACE2）转导的SARS-CoV-2 spike 假病毒感染病证结合小鼠肺炎模型，基于p38MAPK/AP-1 信号通路观察麻杏宣肺合剂对小鼠冠状病毒肺炎炎性因子调控的影响。

1 材料与方法

1.1 动物

雄性昆明种（KM）小鼠，60 只，体重（20±2）g，购于重庆医科大学实验动物中心，动物许可证号：SCXK（渝）2022-0016。小鼠均饲养于IVC 动物房中，12 h/12 h 光暗循环，温度20～25 ℃，湿度（50±5）%，标准固体饲料喂养，自由饮水。动物实验伦理审查编号：IACUC-CQMU-2023-0048。

1.2 实验药物

麻杏解毒合剂（生麻黄、杏仁、石膏、浙贝母、蝉蜕、僵蚕、姜黄、桔梗、枳壳、草果、白豆蔻，批号：20220921），由重庆市中医院制剂室提供。

1.3 试剂与仪器

重组腺相关病毒（H16749 pAAV-CMV-hACE2-P2A-TMPRSS2-FLAG，pAAV-hACE2，标注滴度＞1×1012vg/mL）（批号：HYKY-211124013-YAAV）、SARSCoV-2 spike 假病毒（pSLenti-CMV-EGFP-3xFLAGEF1-Luc-WPRE，标注滴度＞1×107vg/mL）（批号：HYKY-211124001-YSSP），上海和元生物技术股份有限公司，80 ℃冰箱贮存。p38MAPK抑制剂（SB203580），Sigma 公司（批号：TLB0298）；兔p38MAPK 抗体（批号：8690）、兔Phospho-p38 抗体（批号：4511）、兔c-Jun 抗体（批号：9165）、兔c-Fos 抗体（批号：2250），美国CST公司；β-actin（批号：211051028），北京中杉金桥生物技术有限公司；RNAiso Plus（批号9019）、M-MLV RTase cDNA 合成试剂盒（批号：RR047A）、SYBR®Premix Ex Taq Ⅱ试剂（批号：AL51023A），TAKARA 公司。小鼠肿瘤坏死因子-α（TNF-α）（批号：A28230874）、白细胞介素-1β（IL-1β）（批号：A20541671）、白细胞介素-6（IL-6）（批号：A20921102）、IL-8（批号：A20438213）ELISA试剂盒，海联生物科技有限公司；cjun 引物（F：5′-AAGATGGAAACGACCTTCTACG-3′；R：5′-CTTAGGGTTACTGTAGCCGTAG-3′）、c-fos 引物（F：5′-TCTCTAGTGCCAACTTTATCCC-3′；R：5′-GAGATAGCTGCTCTACTTTGCC-3′）、p38MAPK 引物（F：5′-AGGAATTCAATGACGTGTACCT-3′ ；R：5′-AGGTCCCTGTGAATTATGTCAG-3′）和β-actin 引物（F：5′- CTACCTCATGAAGATCCTGACC-3′ ；R：5′-CACAGCTTCTCTTTGATGTCAC-3′），北京擎科生物科技有限公司。PowerpacTM Basic 垂直电泳装置（美国BIO-RAD 公司）；CFX96 Touch RT-PCR 仪（美国BIORAD 公司）；Syneyy HTX 全自动酶标仪（基因有限公司），BBX24B 高通量组织细胞匀浆机（基因有限公司）；icEN-24R 高速冷冻离心机（杭州奥盛仪器有限公司）；Odyssey Fc 双色红外荧光成像系统（美国LI-COR公司）。

1.4 模型制备

60 只KM 小鼠随机分为6 组，即空白对照组、模型组、p38MAPK 抑制剂组、麻杏解毒合剂高剂量组、麻杏解毒合剂中剂量组、麻杏解毒合剂低剂量组，每组10只。除空白对照组以外，其余5 组均置于（90±3）%相对湿度、无风、温度（4±2）℃的人工气候箱中，每天持续4 h后取出，每日1次。寒湿环境造模第1天，取重组腺相关病毒（pAAV-hACE2），每50 μL 加入450 μL PBS 涡旋混匀备用；麻醉机异氟烷气化后麻醉小鼠，采用改良悬挂法，每只小鼠气管内滴注配制好的重组腺病毒液50 μL，给药完成后放入鼠笼中自然苏醒。寒湿环境造模第5 天，取SARS-CoV-2 spike 假病毒，每50 μL 加入250 μL PBS 涡旋混匀备用，各组均采用上述方法，每只小鼠气管内滴注配制好SARS-CoV-2 spike假病毒50 μL，造模结束，当天记为0 d。

1.5 给药方法

造模后第1 天开始给药：p38MAPK 抑制剂组小鼠腹腔注射0.2 mL（1 mg/kg 体质量）p38MAPK 抑制剂，麻杏高剂量组予0.32 mL/10 g 体质量的麻杏解毒合剂灌胃，麻杏中剂量组予0.16 mL/10 g，麻杏低剂量组予0.08 mL/10 g，每日1 次，连续给药4 d。麻杏中剂量组每日给药量的等效剂量为麻杏解毒合剂成人1 d最大量。

1.6 标本采集与检测

1.6.1 血清炎症因子检测 实验结束后，各组小鼠眼球取血并分离血清，参照ELISA 试剂盒说明书分别检测血清中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）和白细胞介素-8（IL-8）的含量水平。

1.6.2 肺组织病理学分析 小鼠眼球取血死亡后，打开胸腔取小鼠右侧肺部，剪取上部两叶于4%多聚甲醛中固定。流水冲洗，组织修块后进行乙醇梯度脱水，二甲苯脱酒精，石蜡包埋，切片（5 μm），60 ℃烘烤切片；切片二甲苯脱蜡，苏木素-伊红染色，树脂封片，显微镜下观察肺组织病理变化。

1.6.3 肺组织p38MAPK、c-jun、c-fos 基因表达 精确称取30～40 mg 小鼠肺组织，匀浆后，12 000×g4 ℃离心，取上清液，按照RNAiso Plus 试剂盒说明书提取肺组织总RNA。按照M-MLV RTase cDNA 合成试剂盒说明书，去除基因中DNA 并逆转录为cDNA。接着，采用SYBR®Premix Ex Taq Ⅱ试剂将上述cDNA进行Real Time PCR 反应，检测p38MAPK、c-jun、c-fos 的mRNA表达水平，并设置β-actin 为内参对照。反应条件为：95 ℃预变性1 min，95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，72 ℃延伸5 min，共38 个循环。数据处理采用2-ΔΔCt法对目的基因进行相对定量分析。

1.6.4 肺组织p38MAPK、p-p38MAPK、c-jun、c-fos 蛋白表达 精确称取50 mg小鼠肺组织，加入裂解液（RIPA∶蛋白酶抑制剂∶磷酸酶抑制剂=100∶1∶1）200 μL 进行匀浆，离心取上清液备用。根据BCA 蛋白浓度测定试剂盒说明书检测样本总蛋白浓度。采用8%SDS-PAGE胶，每孔蛋白上样量60 μg，随后以恒压70 V，30 min后换100 V，50 min 进行电泳，切胶，以250 mA 恒流进行转膜。PVDF 膜浸泡于5%脱脂牛奶中，常温孵育2 h进行封闭，随后于4 ℃摇床轻摇16 h，充分孵育一抗（p38MAPK、p-p38MAPK、c-jun 和c-fos 一抗稀释比例均为1∶1 000），TBST缓冲液洗膜6次后，于室温孵育二抗2 h。ECL 显影液后于成像仪上成像，Image-Pro Plus 6.0（IPP 6.0）软件定量分析光密度值。

1.7 统计学处理

2 结 果

2.1 各组小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6 及IL-8 水平比较

见表1。与空白对照组比较，模型组小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6 及IL-8 含量均明显增加（P＜0.01）。与模型组比较，p38 MAPK 抑制剂组小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 的含量水平均明显降低（P＜0.01），提示阻断p38MAPK 通路可以明显降低病毒性肺炎小鼠血清炎性因子水平。麻杏高剂量组与麻杏中剂量组小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-8的含量水平较模型组均明显降低（P＜0.01），麻杏低剂量组小鼠血清IL-6 和IL-8 的含量水平较模型组亦明显降低（P＜0.01或P＜0.05）。

表1 各组小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-8水平比较（pg/mL，±s）

表1 各组小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-8水平比较（pg/mL，±s）

注：与模型组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01；与空白对照组比较，△P ＜0.05，△△P ＜0.01。下同。

组 别空白对照组模型组p38 MAPK抑制剂组麻杏高剂量组麻杏中剂量组麻杏低剂量组n 10 10 10 10 10 10 TNF-α 7.45±2.24 35.63±9.25△△13.54±2.85**17.44±3.93**24.34±3.91*27.22±5.24 IL-1β 25.91±2.58 50.17±0.85△△25.91±2.95**31.13±2.14**32.87±1.70**36.63±1.54*IL-6 21.23±2.77 48.10±4.11△△28.28±3.32**30.32±3.88**36.96±2.68**38.89±3.47**IL-8 11.13±3.06 78.02±8.21△△52.05±7.69**42.62±4.61***54.84±6.02**60.08±8.13*

2.2 各组小鼠肺组织病理学比较

见图1。空白对照组小鼠肺泡结构清晰，间隔无水肿，肺间质无炎性细胞浸润，细胞结构显示正常。模型组小鼠肺组织肺泡壁、肺间质（血管周围）炎性细胞呈弥漫性浸润，肺泡壁明显增厚，细胞碎片较多，部分小气道腔内见黏液渗出，部分肺泡结构形态改变。p38 MAPK抑制剂组小鼠肺部组织可见炎性细胞浸润，肺泡及肺间质可见轻度充血、肺泡壁可见轻度增厚。麻杏低剂量组、麻杏中剂量组和麻杏高剂量组小鼠肺组织亦可见炎性细胞浸润，肺泡间隔不同程度增厚。随着给药剂量由低到高，小鼠肺组织肺泡壁、肺间质（血管周围）炎性细胞浸润由多到少，肺泡壁厚度由厚到薄，而麻杏高剂量组小鼠肺组织与空白对照组小鼠比较，仅见少量炎性细胞浸润，肺泡及肺间质无明显充血、肺泡壁无明显增厚，接近正常水平。

图1 各组小鼠肺组织病理学改变比较（HE染色）

2.3 各组小鼠肺组织p38MAPK、c-jun、c-fos 基因表达水平比较

见表2。与空白对照组比较，模型组小鼠肺组织中c-fos 基因表达明显增加（P＜0.05），c-jun 基因表达明显下降（P＜0.01），p38 基因表达无明显变化（P＞0.05）；与模型组比较，p38 MAPK 抑制剂组和麻杏高剂量组c-fos 基因表达明显降低（P＜0.01 或P＜0.05），p38基因表达无明显变化（P＞0.05）。

表2 各组小鼠肺组织p38MAPK、c-jun、c-fos基因表达水平比较（±s）

表2 各组小鼠肺组织p38MAPK、c-jun、c-fos基因表达水平比较（±s）

组 别空白对照组模型组p38 MAPK抑制剂组麻杏高剂量组麻杏中剂量组麻杏低剂量组n 10 10 10 10 10 10 p38MAPK 1.000±0.542 1.001±0.643 1.198±0.613 1.719±0.805 1.289±0.644 1.584±0.713 c-jun 0.214±0.071 0.049±0.019△△0.183±0.101*0.052±0.014 0.214±0.153 0.097±0.023*c-fos 0.720±0.187 2.593±0.939△1.131±0.617**2.211±0.562*1.776±0.834 2.293±0.698

2.4 各组小鼠肺组织p38MAPK、p-p38MAPK、c-jun、c-fos蛋白表达比较

见表3、图2。与空白对照组比较，模型组小鼠肺组织中c-fos、c-jun、p-p38 蛋白表达均显著增加（P＜0.05）；与模型组比较，p38 MAPK 抑制剂组、麻杏高剂量组和麻杏低剂量组c-fos 蛋白表达明显降低（P＜0.05），麻杏中剂量组c-jun 蛋白表达明显降低（P＜0.01）；p38 MAPK 抑制剂组、麻杏高剂量组、麻杏中剂量组和麻杏低剂量组小鼠肺组织中p-38 的总蛋白表达水平无明显变化（P＞0.05），而p38 MAPK 抑制剂组及麻杏解毒合剂高、中、低剂量组小鼠肺组织中磷酸化p-38的蛋白表达水平明显降低（P＜0.05）。

图2 各组小鼠肺组织p38MAPK、p-p38MAPK、c-jun、c-fos蛋白表达

表3 各组小鼠肺组织p38MAPK、p-p38MAPK、c-jun、c-fos蛋白表达比较（±s）

表3 各组小鼠肺组织p38MAPK、p-p38MAPK、c-jun、c-fos蛋白表达比较（±s）

组 别空白对照组模型组p38 MAPK抑制剂组麻杏高剂量组麻杏中剂量组麻杏低剂量组n 10 10 10 10 10 10 p-p38MAPK 0.424±0.091 0.771±0.116△0.399±0.055*0.418±0.075*0.338±0.138*0.376±0.155*p38MAPK 0.926±0.278 0.940±0.254 0.959±0.263 0.867±0.148 1.029±0.363 1.032±0.266 c-jun 0.407±0.091 0.742±0.086△0.365±0.062*0.757±0.136 0.168±0.043**0.426±0.160 c-fos 0.408±0.131 0.786±0.118△0.319±0.139*0.386±0.124*0.458±0.143 0.422±0.104*

3 讨 论

临床报道表明，COVID-19 主要症状包括发热、咳嗽、全身肌肉酸痛或疲乏，虽然大多数患者病情轻微，但少数患者（高龄或罹患慢性基础疾病）会出现呼吸困难、严重缺氧，并发急性呼吸窘迫综合征，需要住院和机械通气［5］。而这些重症患者血清C 反应蛋白、血乳酸、乳酸脱氢酶、IL-1β、IL-6 等水平明显高于轻症患者，提示由干扰素、IL、TNF-α 和趋化因子过量释放引起不受控制的全身炎症反应和细胞因子风暴是ARDS的主要机制［6-7］。而体内失控的炎症反应已被证实与病毒性肺炎的重症化密切相关［8］。本研究表明经重组腺相关病毒（pAAV-hACE2）转导的模型组小鼠在寒湿环境下，气管内给予SARS-CoV-2 Spike 假病毒感染后，血清炎性因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α 显著增加（P＜0.01），肺部组织病理切片显示肺间质、肺泡壁炎性细胞浸润明显，肺泡壁充血、水肿，明显增厚，小气管中黏液渗出增加，与新冠病毒感染患者临床病理生理特点吻合［9-10］。而麻杏解毒合剂（高、中剂量组）能明显降低实验小鼠血清炎性因子升高水平（P＜0.01 或P＜0.05），显著减少实验小鼠肺组织炎性细胞浸润，减轻肺泡及肺间质充血、水肿，维持肺泡壁细胞形态稳定及肺泡壁有效换气的生理厚度，是麻杏解毒合剂能有效改善COVID-19 患者发热、咳嗽、喘促临床症状，减少重症化发展的药效学基础。

丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）是细胞内重要的信号传递者，包含4 个亚家族：C-2Jun N 末端激酶/应激活化蛋白激酶（JNKs/SAPKs）、细胞外信号调节蛋白激酶（ERKs），ERK5/大丝裂素活化蛋白激酶1（BMK1）以及p38MAPK。其中p38MAPK 信号途径是MAPK 家族中最重要组成部分，p38MAPK 的激活不仅能促进单核巨噬细胞产生TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 等炎性因子，还可介导中性粒细胞的活化，促进其炎性聚集和呼吸爆发［11］。研究发现SARS-CoV-2 感染导致p38MAPK 通路的异常活化，在参与促炎细胞因子合成和释放，血管收缩、通透性增高，血栓形成中起关键作用，并与急性肺损伤和心肌功能障碍密切相关［12］，这也是COVID-19 患者重症化的重要原因［13］。本研究显示模型组小鼠肺组织内p-p38 蛋白表达均显著增加（P＜0.05），而p38 基因表达和p38 总蛋白水平无明显变化（P＞0.05），与现有研究报道［14］结果相似，提示SARS-CoV-2 等病毒感染可能直接导致p38MAPK 蛋白磷酸化，从而介导p38MAPK 通路的异常活化。本研究还显示麻杏解毒合剂能使实验小鼠肺组织中磷酸化p-38的蛋白表达水平明显降低（P＜0.05），揭示其疗效靶点在于抑制p38MAPK 蛋白的磷酸化激活，从而中断由p-p38导致的炎性因子不可控释放的正反馈回路。

激活蛋白-1（AP-1）是一种由Fos、Jun、激活转录因子（ATF）亚基的同源二聚体和异二聚体组成，与许多基因的启动子结合的中心转录因子复合物，是调节细胞增殖、分化和凋亡的关键转录因子［15］。本研究显示模型组小鼠肺组织中c-fos 基因表达明显增加（P＜0.05），c-fos、c-jun 蛋白表达也显著增加（P＜0.05），与p-p38 蛋白表达增加导致AP-1 基因活化有关；与模型组比较，麻杏高、低剂量组c-fos 蛋白表达明显降低（P＜0.05），麻杏中剂量组c-jun 蛋白表达明显降低（P＜0.01），显示麻杏解毒合剂能抑制上游p38MAPK蛋白的磷酸化激活，下调下游AP-1 基因及蛋白表达。而相较于本研究结果中血清炎性因子和p-p38 表达呈现一致性降低，麻杏解毒合剂对AP-1基因及蛋白表达未显示出一致的剂量依赖性降低，我们考虑与AP-1作为基因转录的分子开关，受到细胞因子、生长因子、氧化应激、病毒和细菌感染等多种内在和外在的刺激和环境损伤所诱导活化［16］，受除p38MAPK以外的MAPKs信号通路中JNKs、ERKs、BMK1 和NF-κB 通路等多种信号通路调节有关。

本研究证明麻杏解毒合剂能明显降低病毒性肺炎小鼠血清炎性因子水平，显著减轻炎性渗出，其疗效机制与麻杏解毒合剂能抑制p38MAPK 蛋白的磷酸化激活，下调AP-1 基因及蛋白表达，从而减少炎性因子的合成和释放，降低冠状病毒感染导致炎性因子释放引发的肺组织损伤有关。病毒感染导致的炎性反应涉及多通路、多靶点的病理生理过程，而复方中药在体内作用机制也表现多靶点调节。本研究仅明确了麻杏解毒合剂对于p38MAPK/AP-1 通路的作用，尚待进行与体内炎症反应相关其他通路的进一步研究。