不同添加剂处理柞树叶青贮对延边黄牛体外发酵瘤胃降解率和微生物菌群的影响

潘敏慧，黄小乘，田怡豪，孙占微，李成云,2,3

（1.延边大学农学院, 吉林 延吉 133002；2.延边大学肉牛科学与产业技术协同创新中心, 吉林 延吉 133002；3.东北寒区肉牛科技创新教育部工程研究中心, 吉林 延吉 133002）

青贮饲料是一种营养丰富、适口性好，易于吸收的饲料，是反刍动物的重要饲料来源[1]。柞树叶的蛋白质含量较高，是一种比较优质的蛋白质饲料资源。张栋等[2]观测不同粗纤维(玉米秸叶、柞树叶)来源日粮对东北梅花鹿瘤胃内环境的影响，结果表明以柞树叶为粗纤维来源组成的日粮对东北梅花鹿营养需求与瘤胃发酵更为有利。青贮柞树叶的粗蛋白质、粗脂肪含量都高于青贮玉米秆的含量，而粗纤维的含量却比青贮玉米低[3]。青贮添加剂的使用已有百年多的历史，如今使用的添加剂种类已超过百种。青贮添加剂分为青贮发酵促进剂、有害微生物抑制剂、营养添加剂和好氧性变质抑制剂[4]。青贮添加剂一般具有防止青贮饲料腐败、提高青贮饲料的营养和改善饲料适口性的作用[5]。如今，多种青贮添加剂被商业化而广泛的生产使用。有研究表明，在青贮玉米中以乳酸菌作为添加剂可以减少3%的青贮原料损耗[6]。张嘉懿等[7]研究表明，单独或混合添加不同发酵类型乳酸菌都提高了青贮品质。乳酸菌添加剂在提高青贮品质的同时对动物的生产性能具有影响，如饲料利用率[8]。但也有研究表明，加乳酸菌添加剂后青贮饲料发酵品质并没有明显的提升，却对动物的生产性能有益[9]。同时，添加菌剂处理的青贮饲喂反刍动物后对其瘤胃具有一定的影响[10]。糖蜜是一种富含碳水化合物的物质，主要是为乳酸菌提供更多的有效能，有利于乳酸发酵。有些研究表明，青贮时添加糖蜜，会降低pH 和氨态氮，增加乳酸、乙酸以及可溶性碳水化合物含量，并提高青贮品质[11-12]。柞树叶青贮处理后有利于其保存和品质的提高，但不同添加剂处理柞树叶青贮对瘤胃降解率和微生物菌群的影响研究鲜有报道。因此，拟研究不同添加剂处理柞树叶青贮对延边黄牛瘤胃降解率和微生物菌群的影响，以期筛选出最佳的发酵添加剂，为青贮柞树叶在反刍动物上的实际应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

柞树叶于2021 年9 月中旬在延边朝鲜族自治州草原管理站采集，其化学成分为干物质含量(DM) 41.32%、粗 蛋 白 质(CP) 14.17、粗 脂 肪(EE)6.64、粗灰分(ASH) 3.00、酸性洗涤纤维(ADF)48.07、中性洗涤纤维(NDF) 55.96、钙(Ca) 0.96、磷(P) 0.21 和缩合单宁(CT) 4.22。糖蜜由国药集团化学试剂有限公司提供，乳酸菌和EM 菌由延边大学农学院动物营养实验室提供，1%石灰水由无水氢氧化钙配制。

1.2 试验设计

试验采用单因子试验设计，对照组用无添加剂处理，其余6 组试验组分别用乳酸菌、糖蜜、石灰水和EM 菌，或者是其中两者结合，不同处理均设3 个重复，具体试验设计如表1 所列。

表1 试验设计Table 1 Experimental design

1.3 试验动物及饲粮

选择平均体重为(443.3 ± 26.7) kg、年龄在1.5～2岁装有永久性瘤胃屡管的延边黄牛公牛4 头。基础饲粮按照美国NRC (2000)生长育肥阶段配制，每日定时饲喂2 次(07:00 和16:00)，自由饮水。将不同添加剂处理的紫柞树叶青贮添加到日粮中进行试验。基础饲粮组成及营养水平如表2 所列。

表2 试验饲粮组成及营养水平Table 2 Composition and nutrient levels of experimental diets

1.4 方法

1.4.1 青 贮饲料调制

青贮柞树叶调制的具体方法和步骤参考潘敏慧等[13]试验方法。

1.4.2 瘤 胃液采集

在晨饲前2 h 内经瘤胃瘘管采集3 头试验牛的瘤胃液，用8 层纱布过滤后，迅速置于提前预热至39 ℃的保温瓶中带回实验室。

1.4.3 体 外培养

参照Menke 等[14]的方法配制瘤胃缓冲液，将人工瘤胃液与采集的牛瘤胃液以2 ꞉ 1 的比例进行混合，用于青贮柞树叶体外发酵。每1 g 柞树叶，加入70 mL 人工瘤胃液。每组每个重复称取2 g 青贮柞树叶样品放入尼龙袋，置于有发酵培养液的体外发酵瓶中，在(39 ± 0.5) ℃恒温水浴摇床中培养发酵48 h。

1.4.4 样品的采集及瘤胃DNA 的提取

发酵48 h 之后，对微生物样品进行采集，具体方法和步骤参考黄小乘[15]试验方法。

1.4.5 引 物设计及PCR 扩增

引物由北京百迈客生物科技有限公司合成，用引物338F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和反 向 引 物806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTA AT-3′)对V3-V4 区进行全长16S rRNA 基因的聚合酶链式反应扩增，聚合酶链式反应程序、具体方法和步骤参考黄小乘[15]试验方法。

1.5 测定指标及方法

1.5.1 降 解率的测定

发酵结束后，取出尼龙袋，冲洗干净后放在65 ℃烘箱中充分烘干至恒重并称重记录，用于DM、CP 以及NDF 含量的测定，并计算降解率。

1.5.2 高通量测序数据统计

测序完成后，按照Li 等[16]的描述进行序列提取、过滤和优化。使用UCLUST 基于97%的相似度水平识别将唯一序列集划分OTU (operational taxonomic units)[17]。最后，使用Mothur 3 软件将代表性序列与Silva (细菌)数据库进行比较，获得分类信息[16]。采用QIIME 软件计算α 多样性指数，绘制香农指数曲线和稀释度曲线，使用ANOVA 方法进行显著物种差异分析，进行主成分(PCoA)分析，微生物相关性分析、功能预测分析等[18]。

1.6 数据处理

采用Excel 2010 记录试验数据并进行基础数据计算，使用SPSS 26.0 进行单因素方差分析，并通过最小显著性差异法(LSD)和邓肯(Duncan)法对各组的平均值进行多重比较，P< 0.05 表示差异显著。数据结果用“平均数 ± 标准差”表示。

2 结果

2.1 不同发酵添加剂的青贮柞树叶对延边黄牛瘤胃降解率的影响

与对照组相比，各组青贮柞树叶干物质降解率、粗蛋白质降解率和中性洗涤纤维降解率都有了显著的提高(P< 0.05) (表3)。其中，M 组和LAB-M组的干物质降解率差异不显著(P> 0.05)，其他各组间干物质降解率差异显著(P< 0.05)；EM-M 组的粗蛋白质降解率显著高于其他试验组(P< 0.05)，LABM 组的粗蛋白质降解率显著低于除对照组以外的其他试验组(P< 0.05)；LAB-M 组和EM 组的中性洗涤纤维降解率差异不显著(P> 0.05)，其他各组间中性洗涤纤维降解率差异显著(P< 0.05)。在除对照组和W 组以外的各个试验组中，LW 组的干物质降解率、粗蛋白质降解率和中性洗涤纤维降解率显著低于其他4 个组(P< 0.05)。

表3 不同发酵添加剂的青贮柞树叶对延边黄牛瘤胃体外发酵干物质、粗蛋白质和中性洗涤纤维降解率的影响Table 3 Effects of silage oak leaves with different fermentation additives on degradability of dry matter, crude protein and neutral detergent fiber of rumen fermentation in vitro in Yanbian yellow cattle%

2.2 不同发酵添加剂的青贮柞树叶对延边黄牛瘤胃体外发酵微生物菌群的影响

2.2.1 瘤 胃内容物PCR 扩增结果

试验电泳PCR 结果如图1 所示，片段大小约为500 bp，条带清晰明亮，可以满足瘤胃微生物高通量测序的要求。

图1 琼脂糖凝胶电泳检测PCR 结果Figure 1 PCR results detected by agarose gel electrophoresis

2.2.2 瘤胃液样品测序数据质量评估

对21 份样本的16S rRNA 基因V3 和V4 区进行高通量测序共获得1 610 208 对有效序列，并进行了质控和优化，完全能够满足高通量测序要求。通过对各阶段样品序列数目进行统计及数据处理，得到的各样品测序数据评估结果如表4 所列。LW 组的有效序列数显著高于EM 组(P< 0.05)，其余各组间差异均不显著(P> 0.05)；。

表4 不同发酵添加剂的青贮柞树叶对延边黄牛体外发酵瘤胃液样品测序数据质量评估Table 4 Quality evaluation of sequencing data of in vitro-fermented rumen fluid samples of Yanbian yellow cattle by silage oak leaves with different fermentation additives

2.2.3 瘤胃微生物OTU 丰度、丰富度和多样性

如图2 所示，不同样品的OTU 个数随测序深度的增加而增加，细菌群落稀释性曲线逐渐平缓，OTU 个数达到饱和，表明本研究用于测序的数据量足够大，测序结果能够准确反映延边黄牛瘤胃微生物物种多样性。通过扩增子测序，在97%的相似度水平下进行聚类后，各试验组间得到的细菌群落OTU 个数为897～909，各试验组间OTU 个数与对照组无显著差异(P> 0.05)，表明不同发酵添加剂对延边黄牛瘤胃细菌群落OTU 个数影响不显著(P> 0.05)。

图2 细菌群落稀释性曲线Figure 2 Dilution curve of bacterial community

如表5 所列，各组的OTUs 和α 多样性指数无显示差异，说明不同的青贮发酵添加剂处理后对瘤胃微生物丰度和多样性的影响不显著(P> 0.05)。

表5 不同发酵添加剂的青贮柞树叶对延边黄牛体外发酵瘤胃细菌群落分类操作单元数(OTUs)和α 多样性指数统计的影响Table 5 Effects of silage oak leaves with different fermentation additives on the number of classified operating units (OTUs) and α diversity index of the rumen bacterial community in the in vitro-fermentation of Yanbian yellow cattle

2.2.4 瘤 胃 细 菌 群 落 结 构

不同发酵添加剂的延边黄牛瘤胃细菌群落在门水平和属水平上的相对丰度居于前10 的物种如图3 和图4 所示。7 种不同处理的样品共检测到细菌分属于11 门、16 纲、40 目、83 科和179 属。

图3 不同发酵添加剂的青贮柞树叶对延边黄牛瘤胃细菌群落门水平物种相对丰度的影响Figure 3 Effects of silage oak leaves with different fermentation additives on the relative abundances of phyla in the rumen bacterial community of Yanbian yellow cattle

图4 不同发酵添加剂的青贮柞树叶对延边黄牛瘤胃细菌群落属水平物种相对丰度的影响Figure 4 Effects of silage oak leaves with different fermentation additives on the relative abundances of genera in the rumen bacterial community of Yanbian yellow cattle

细菌门水平上，变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidota)、厚壁菌门(Firmicutes)和弯曲杆菌门(Campylobacterota)为各组的优势菌门，其相对丰度分别为27.36%～36.87%、 21.06%～37.58%、21.64%～38.56%和3.99%～16.08% (图3)。与对照组相比，各试验组的变形菌门相对丰度有所增加；与对照组相比，拟杆菌门相对丰度仅EM-M 组中增加，其余组则降低；LAB-M 组、EM 组和LAB 组的厚壁菌门相对丰度比对照组多，其余试验组则少。在各个组中LW 组的弯曲杆菌门的相对丰度比其他菌门都高。

细菌属水平上，不动杆菌属(Acinetobacter)、普氏菌属(Prevotella)、弓形杆菌属(Arcobacter)和理研菌科RC9 肠道群(Rikenellaceae_RC9_gut_group)为各试验组的优势菌属，其相对丰度分别为19.45%～32.03%、9.46%～17.09%、3.63%～15.78%和4.41%～6.64% (图4)。与对照组相比，除LAB-M 组和EM 组的不动杆菌属相对丰度有所降低外，其余组均增加；普氏菌属相对丰度在各试验组中均有所降低；弓形杆菌属相对丰度在LW 组和M 组中分别升高，而余下4 组分别降低。

为进一步明确各试验组间在群落物种组成上的差异性，采用PCoA 分析不同发酵添加剂的延边黄牛体外发酵瘤胃细菌群落组间差异。如图5 可知，细菌群落PC1 和PC2 的累计贡献率达81.86%，即根据主成分分析表明，细菌群落PC1 和PC2 分别可解释总变异的34.34%和47.52%。不同试验组间物种组成存在差异。其中，LW 组和其他组在图中距离较远，表明该组和其他各组组间差异较大。而余下6 组样品在图中强烈聚类，表明这几组样品组内重复性较好，且组间差异较小。

图5 细菌群落结构PCoA 聚类分析图Figure 5 PCoA cluster analysis of bacterial community structure

2.2.5 瘤胃细菌群落微生物功能分布差异

为探究不同处理组微生物群落在功能分布上的差异，对细菌群落进行功能预测。结果如图6 所示，细菌群落功能预测共有6 大类，其中，对照组中新陈代谢的功能分丰度大于其他各组，但无显著差异(P> 0.05)。

图6 延边黄牛瘤胃细菌群落的功能预测Figure 6 Functional prediction of the rumen bacterial community of Yanbian yellow cattle

2.2.6 瘤胃微生物相关性分析

因前期已做过不同发酵添加剂对青贮柞树叶发酵品质和瘤胃体外发酵参数的影响，在此探究不同发酵添加剂处理后的微生物相关性分析。如图7 和图8 所示，在门水平上，理化因子1 (青贮品质和青贮营养成分)和理化因子2 (瘤胃体外发酵特性)分别解释了为60.99%和49.00%的变异。如图7 所示，在青贮品质和青贮营养成分中影响细菌群落的主要理化因子是ASH、NH3-N/TN 和pH；如图8 可知，在瘤胃体外发酵特性中影响细菌群落的主要理化因子是pH、AA 和总产气量。

图7 细菌群落门水平群落结构与青贮品质和青贮营养成分的理化因子RDA 分析Figure 7 RDA analysis of physicochemical factors of bacterial community structure at the phylum level, silage quality, and nutrient composition

图8 细菌群落门水平群落结构与细菌群落门水平群落结构与瘤胃体外发酵特性的理化因子RDA 分析Figure 8 RDA analysis of physicochemical factors of the phylum level community structure and in vitro rumen fermentation characteristics

通过对门水平上的优势菌门即变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门和弯曲杆菌门与理化因子青贮品质、青贮营养成分和瘤胃体外发酵特性进行了斯皮尔曼等级分析。结果如图9 和图10所示，在青贮品质和青贮营养成分上，拟杆菌门相对丰度与AA 和WSC 分别显著或极显著正相关(P< 0.05)，而与DM 和ASH 分别显著或极显著负相关(P< 0.05)；弯曲杆菌门相对丰度与pH 和NH3-N 显著正相关(P<0.01)；变形菌门相对丰度仅与ASH 具有显著正相关(P< 0.01)。在瘤胃体外发酵特性上，4 个优势菌门中仅弯曲杆菌门相对丰度与pH 具有极显著相关性且为正相关。厚壁菌门与各个理化因子均无显著的相关性。

图9 青贮品质和青贮营养成分与细菌群落门水平相关性热图Figure 9 Heat map of the correlation between silage quality, silage nutrient composition and bacterial community phylum level

图10 瘤胃体外发酵特性与细菌群落门水平相关性热图Figure 10 Heat map of the correlation between the in vitro rumen fermentation characteristics and phylum level of the bacterial community

3 讨论

3.1 不同发酵添加剂的青贮柞树叶对延边黄牛瘤胃降解率的影响

饲料的营养价值可通过营养物质的降解率来评定。瘤胃微生物的健康生长关系着瘤胃的正常发酵，而瘤胃微生物生长和蛋白合成所需的氮源主要来自于饲料中的粗蛋白[19]。瘤胃发酵则反映了反刍动物利用瘤胃中微生物对营养物质进行发酵和分解的能力[20]。粗蛋白降解率除了与蛋白质的来源有关外，还与其结构有关[21]。同时，还取决于饲料蛋白质发酵的难易程度和在瘤胃内滞留时间[22]。此外，粗蛋白降解率也与发酵条件有关，如体外发酵会造成粗蛋白降解率的降低[23]。反刍动物蛋白质的需要量可以通过瘤胃蛋白质的降解率来进行评估[24]。饲料中干物质和中性洗涤纤维降解率是影响饲料营养成分在反刍动物体内消化和吸收效率的重要因素[25]。木质素是一种结构复杂的中性洗涤纤维，瘤胃微生物无法将其有效利用，因此，木质素在中性洗涤纤维中的比例是影响中性洗涤纤维降解率的主要因素[19]。已有些研究表明在青贮饲料中，添加乳酸菌提高了中性洗涤纤维降解率[25-27]。DM 降解率会影响到DM 采食量，瘤胃DM 降解率又与饲料的来源有关。瘤胃微生物利用DM 的能力，可用DM 降解率来评估，DM 降解率越高，瘤胃发酵效果就越好[28]。瘤胃中DM 降解率与粗饲料的种类和培养时间有关，培养时间越长，不同种类粗饲料DM 降解率增加的程度和幅度不一致[29]。越成熟的植物，其DM 降解率就越低，这主要是由植物细胞内容物增加，可消化细胞壁含量降低引起的[30]。目前，青贮添加剂种类较多，试验条件无法完全一致，青贮添加剂对瘤胃降解率影响的结论还未完全统一。本研究中，不同发酵添加剂组的营养物质降解率也有显著差异(P< 0.05)，各青贮柞树叶试验组的DM、粗蛋白质以及中性洗涤纤维的降解率均较对照组有显著升高(P< 0.05)，与Silva 等[31]在青贮柱花草试验中添加纤维素酶和乳酸菌，可有效地提高瘤胃降解速率的结果一致。这可能是因为纤维素酶可将植物细胞的细胞壁降解成如单糖等更易被瘤胃吸收的营养物质，进一步提高了瘤胃降解率。乳酸菌是青贮发酵促进剂，通过增加乳酸菌的数量，进而促进水溶性碳水化合物(water soluble carbohydrate, WSC)被乳酸菌利用而产生更多的乳酸，青贮内环境迅速酸化，对有害微生物进行抑制，可减少青贮饲料中干物质的损失，这可能有利于瘤胃微生物对干物质的利用。因此，WSC 在青贮过程中微生物的能量代谢起着关键作用。大量乳酸菌发酵利用部分纤维而导致青贮饲料的中性洗涤纤维降低，也可能是初期细胞呼吸和酶解过程所导致，进一步提高了瘤胃中性洗涤纤维的降解率[32]。酶菌之间存在协同作用，可进一步促进青贮饲料的发酵，改善饲料营养价值。冯鹏等[33]通过对玉米秸秆和马铃薯渣混贮饲料进行酶、菌和酶菌复合处理后提高了反刍动物瘤胃对营养物质的降解效率，与本研究结果一致。其中，酶菌复合处理组效果最佳，酶处理组次之，最后为菌处理组。因此，后期可进一步考虑酶菌复合处理青贮饲料的相关研究。Mordenti 等[34]认为，糖蜜有利于反刍动物对营养物质的消化吸收，该试验中添加糖蜜后发现显著升高了DM、粗蛋白质以及中性洗涤纤维的降解率(P< 0.05)。EM 组和EM-M 组降解率增加显著，说明EM 处理和EM + 糖蜜处理能够有效提高饲料利用率。EM 菌是一种混合菌一般包括光合菌、酵母菌、乳酸菌等有益菌类。本研究中EM 组 和EM-M 组 的 降 解 率 有 显 著 差 异(P< 0.05)，说明EM 菌与糖蜜可能存在叠加效应。推测可能是EM 菌如酵母菌与瘤胃内微生物具有协同效应，刺激瘤胃中分泌纤维素酶微生物的生长，促进瘤胃内营养物质的消化，糖蜜则是为瘤胃中的微生物提供能量促进发酵微生物的生长增殖，让瘤胃内容物可以更充分发酵。益生菌有利于缓解反刍动物的酸中毒症状，主要是因为益生菌通过稳定pH 和为瘤胃微生物提供营养物质对瘤胃环境具有积极作用[35]。潘峰等[36]通过在肉牛日粮中添加酵母培养物和糖蜜后提高了中性洗涤纤维的表观消化率，但两者混合添加对改善肉牛消化率并无叠加效应，引起差异的原因除了最主要的测定指标不同外，还可能是动物品种，日粮结构和发酵环境差异等。关于营养物质的表观消化率和体外瘤胃降解率的确切关系目前还不清楚，并且将体外实验结果外推到体内条件是有局限性的，后续还需研究。

3.2 不同发酵添加剂的青贮柞树叶对延边黄牛体外发酵的瘤胃微生物OTU 丰度、丰富度、多样性和功能分布差异的影响

瘤胃是反刍动物消化道中体积最大的一部分，它包含复杂的微生物生态系统，微生物菌群种类繁多，一般主要包括细菌、原虫和真菌[37]。在瘤胃微生物区系中细菌占优势菌的主导地位，它们对饲料的消化和微生物蛋白的合成有着非常突出的贡献[38]。微生物多样性与饲粮有关，饲粮组成越复杂，微生物多样性就越高[39]。庞凯悦等[40]发现，全混合日粮舍饲和放牧的牦牛瘤胃内非纤维物质的降解菌以及半纤维降解菌属的相对丰度存在差异，说明饲养方式对瘤胃微生物菌群具有影响。有研究表明，微生物的菌群种类和丰富度与动物的年龄有关[41]。解彪等[42]发现随着反刍动物年龄的增长变形菌门的丰富度会逐渐下降至最初的1/8，而在每个样品中却可以检测到丰富的拟杆菌门。断奶前后犊牛的瘤胃中除拟杆菌门外，厚壁菌门也比其他菌门类丰富[43]。动物的生理状态也影响着菌群多样性和丰度，有研究表明正常组牦牛犊牛的菌群多样性和丰度均高于腹泻组[44]。细菌丰度也与瘤胃的pH 有关，降低环境pH，革兰氏阴性菌的丰度也会减少[45]。菌群相对丰度与发酵时间有关，张林等[46]发现，在门和属水平优势菌群的相对丰度随发酵时间显著变化，说明优势细菌种类发生了变化，但在菌群种类未受饲粮和发酵时间的影响。有些研究表明，品种对瘤胃细菌群落组成也有影响。刘开朗等[47]通过比较分析后发现，牛的品种对瘤胃微生物群落组成的影响大于日粮或其他因素。瘤胃微生物发酵的初期阶段，不同品种牛不光是细菌的数量、发生率和种类有显著变化，真菌亦是如此[48]。但也有一些研究表明，品种对瘤胃微生物的影响并不明显，所以有学者提出品种影响瘤胃微生物群落组成和数量，需在日粮、动物健康、环境等条件相同的情况下。由上所述可知众多因素影响着瘤胃微生物的相对丰度，所以反刍动物瘤胃内的优势菌群种类并不是绝对的，目前关于反刍动物瘤胃优势微生物排序是无法完全确定的。相同物种丰度的情况下，Simpson 指数值越小，Shannon 指数值越大，说明样品的物种多样性越高[49]。在本研究中，不同处理组中的瘤胃细菌群落分类操作单元数(OTUs)和α 多样性指数均显著性差异，说明不同青贮发酵添加剂处理对瘤胃细菌群落无显著影响。

3.3 不同发酵添加剂的青贮柞树叶对延边黄牛瘤胃细菌群落结构的影响

瘤胃的消化与菌群数量的变化有着密切的关系[50]。本研究中，瘤胃微生物组成方面，各组门水平上变形菌门和拟杆菌门以及厚壁菌门是反刍动物瘤胃内的主要微生物菌群，这与赵梦迪[51]和王祖艳等[52]的结论一致。在育肥羔羊瘤胃内，这3 种主要微生物菌群的变化与粗纤维含量有关。李希等[53]通过探究提高饲粮纤维水平对育肥羔羊瘤胃微生物组成及多样性的影响后发现，在门水平上，粗纤维水平增加前以拟杆菌门和变形菌门为主，粗纤维水平增加后，瘤胃微生物以拟杆菌门和厚壁菌门为主。各组属水平优势菌群为不动杆菌属、普氏菌属、弓形杆菌属和理研菌科RC9 肠道群。普氏菌属属于拟杆菌门，其可以对蛋白质进行降解，促进非纤维多糖和果胶的降解[54]。有研究表明，普氏菌属有直接降解纤维或协作降解纤维的能力[55]。本研究中，不同青贮发酵添加剂降低了普氏菌属的相对丰度，但是却显著提高了中性洗涤纤维降解率，产生这种结果的原因可能是普氏菌属相对丰度降低的效果并不显著，并不会影响到其他瘤胃微生物对中性洗涤纤维的整体降解效率或各种菌属在不同的个体中的主要作用是有差异的。有结果显示，理研菌科RC9 肠道群在维护肠道健康方面有重要作用[56-57]。本研究中，LAB-M 组和EM 组的中性洗涤纤维降解率显著高于其他组，可能与理研菌科RC9 肠道群相对丰度的增加有关。瘤胃中超过一半的脲酶由变形菌门产生[58]。在本研究中，与对照组相比，各试验组中的变形菌相对丰度均有所增加。植食性动物能够充分消化利用植物来源的食物，与肠道中的厚壁菌门和拟杆菌门有关，因此，在植食性动物的肠道微生物群落中厚壁菌门和拟杆菌门的含量较高，这也是此类动物自身的一种特征[59]。有研究表明，碳水化合物和蛋白质的水解与合成和厚壁菌门与拟杆菌门共同作用有关[60-61]。反刍动物对营养物质的吸收和能量的存储与各种菌门的相对丰度比值有关，如厚壁菌门与拟杆菌门这两类微生物对动物的营养吸收和能量储存起到了共同促进的作用[44]。反刍动物瘤胃菌群丰度的变化因为影响着动物自身对营养物质的吸收利用，所以对动物的生产性能具有影响。反刍动物日增重与厚壁菌门的丰度存在显著的相关性，反刍动物饲料利用效率又受菌群丰度的影响[62]。厚壁菌门和拟杆菌门对改善反刍动物机体脂肪的沉积影响较大[63]。本研究中，与对照组相比，EM-M 组中的拟杆菌相对丰度增加，可能是EM 菌与拟杆菌具有协同效应，说明EM + 糖蜜处理可促进营养物质的消化吸收。对于厚壁菌门而言，与对照组相比，LABM 组、EM 组和LAB 组中其相对丰度分别增加，而余下的3 个试验组的相对丰度降低，差不多与拟杆菌门相对丰度的变化相反，这可能与瘤胃的pH 有关。Hook 等[64]通过研究亚急性瘤胃酸中毒(SARA)的适应和恢复对高谷物喂养后瘤胃细菌密度和多样性的影响发现，瘤胃pH 的变化对瘤胃微生物具有影响，当pH 降低时会减少拟杆菌门的数量，却增加了厚壁菌门的数量。有研究表明，在饲粮中添加酵母培养物、糖蜜、或同时添加都影响了拟杆菌门和厚壁菌门的相对丰度[36]。但在本研究中，仅EM-M 组高了拟杆菌门的相对丰度，并降低了厚壁菌门的相对丰度，而M 组和LAB-M 组却不是这样的变化，这可能与动物、饲粮组成和发酵条件有关，如动物的生理状态和饲粮中的抗营养因子也会对微生物造成影响。赵梦迪[51]通过在青贮野火球中添加低水平缩合单宁后发现，低水平的缩合单宁对革兰氏阳性菌活性和分解纤维素类物质的微生物丰度具有抑制作用。柞树叶中主要的抗营养因子为单宁，笔者前期的试验结果也已表明不同青贮添加剂显著降低了柞树叶青贮饲料的缩合单宁含量[13]。厚壁菌门属于分解纤维类物质微生物，但本研究中相对于对照组而言LAB-M 组、EM 组和LAB 组却增加了厚壁菌门相对丰度，这可能是与发酵时间和各组中降低后的柞树叶青贮饲料中的缩合单宁含量多少有关。同时，适量的单宁可提高动物的生产性能，有研究表明在湖羊日粮中添加单宁可提高湖羊的平均日增重、屠宰率和免疫力，并降低料肉比且对器官发育无不良影响[65]。动物的生理状态也影响着厚壁菌门和拟杆菌门的相对丰度，当动物腹泻时会降低拟杆菌门和厚壁菌门的相对丰度占比[44]。反刍动物瘤胃中杆菌门相对丰度的提高，有利于动物对纤维素的降解消化。

在PCoA 分析中发现，LW 组的延边黄牛瘤胃细菌群落组成与对照组以及其他试验组有较大差异。瘤胃内环境稳态、发酵状态和瘤胃微生物正常生长繁殖与瘤胃pH 有关[66]。有研究表明，反刍动物瘤胃液的pH 正常范围是6.5～7.5。从门水平上看，LW 组的弯曲菌门的相对丰度是最高的，弯曲菌门是革兰氏阴性菌，而瘤胃中降低pH，会减少革兰氏阴性菌的丰度[43]。石灰水呈碱性，其添加可能提高了pH，从而对瘤胃微生物产生了一定影响(如提高了LW 组的弯曲菌门的相对丰度)，造成LW 组与其它组的瘤胃细菌群落组成有较大差异，这可能也是所有试验组中，LW 组与CK 组瘤胃降解率相差最小的原因。Liu 等[67]以碳酸氢铵与石灰的混合物作为熏蒸剂几乎没有对土壤微生物活性和群落结构产生不利影响。当然反刍动物瘤胃微生物和土壤微生物还是有一定的差异的，但目前关于石灰水对动物体内微生物影响的相关研究较少。相较通过宏基因组研究，PICRUSt 功能分析具有方便、成本低和结果可靠性高等优点[68]。本研究将高通量测序结果进行PICRUSt 功能预测分析。结果表明，不同发酵添加剂的青贮柞树叶处理的延边黄牛瘤胃细菌主要涉及新陈代谢、遗传信息处理和环境信息处理等6 个生物代谢通路。其中，各个组均是新陈代谢的功能丰度占比最大，说明瘤胃发酵过程中大多数细菌都参与了瘤胃内食糜的代谢，也正是多种微生物的生长代谢促进了反刍动物对饲料营养物质的消化吸收与利用。

3.4 不同发酵添加剂的青贮柞树叶对青贮品质、青贮营养成分和瘤胃体外发酵参数与瘤胃微生物的相关性研究

前期已做过不同发酵添加剂对青贮柞树叶发酵品质及青贮营养成分的影响[13]。本研究通过青贮品质、青贮营养成分和瘤胃体外发酵参数与瘤胃微生物的相关性分析，发现AA、DM、pH、NH3-N 和ASH、WSC 与瘤胃微生物相对丰度呈显著或极显著相关，但厚壁菌门与各个理化因子均无显著的相关性。有研究表明，在不同饲养方式下NH3-N 浓度与瘤胃微生物菌群之间无显著相关性[40]。厚壁菌门的许多成员都是有益菌，瘤胃球菌属是厚壁菌门的成员之一。蒲小宁等[69]探究了小尾寒羊母羊不同繁殖阶段瘤胃发酵功能及微生物菌群变化特征对其繁殖性能的影响，将属水平上的前20 优势物种与NH3-N 等理化因子进行相关性分析，结果表明瘤胃球菌属与NH3-N 存在显著正相关性，与本研究结果不一致，这可能是试验动物和进行分析的微生物水平不同造成的。不同的理化因子可能对瘤胃微生物的相对丰度具有影响，但反刍动物的瘤胃是一个非常复杂的系统，理化因子对微生物的影响也不是单一的，如各个理化因子之间或不同微生物之间可能存在的互作效应等，所以综合性的相关分析仍需进一步探究。

4 结论

通过在柞树叶青贮过程中不同青贮添加剂的使用，在一定程度上改善了瘤胃发酵环境，提高了瘤胃降解率。各试验组对于延边黄牛瘤胃微生物整体区系构成、微生物多样性以及微生物的丰度均无显著影响。综合各项指标进行评价，各组改善了瘤胃发酵环境效果从高到低依次表现为EM-M 组 >LAB-M 组 > M 组 > EM 组 > LAB 组 > LW 组 >CK 组，即EM-M 组提升瘤胃发酵环境效果最优。