辣木叶与黄梁木叶混贮的组合效应：发酵参数和蛋白质水解

■ 李紫欣 董晨曦 刘 萍 张 微，2 和立文，2*

（1.中国农业大学动物科学技术学院，畜禽营养与饲养全国重点实验室，北京 100193；2.中国农业大学三亚研究院，海南三亚 572000）

辣木和黄梁木是（亚）热带地区优质的木本饲料资源，产量高，营养丰富，且富含多种药用活性成分，是重要的饲料蛋白和功能成分来源。由于反刍动物对非蛋白氮的沉积效率普遍低于真蛋白，因此青贮过程中蛋白质大量降解会降低青贮饲料的饲用价值。前期研究表明，高水分辣木叶青贮过程中有超过一半的蛋白质发生水解，而高水分黄梁木叶青贮的蛋白质水解却很少，可能与其较高的单宁含量及特别的蛋白酶活性有关。据此推测，混入黄梁木叶可能有助于抑制辣木叶青贮的蛋白质水解，改善青贮品质。

辣木（Moringa oleifera），辣木科辣木属的多年生热带落叶乔木，原产于印度，广泛种植于非洲、亚洲的热带及亚热带地区，在我国云南、贵州、广东、海南等地均有种植。由于其具有丰富的生物活性（抗氧化性、抗菌性）、营养价值高[1-2]和产量大[3]的特点，被世界广泛种植并应用于医药、食品、饲料及工业生产。目前，辣木还被开发成家畜重要的蛋白质来源和功能性饲料。研究表明，在奶牛饲粮中添加辣木（或提取物），不仅可以改善动物饲料利用效率、生产性能和健康状况[4-6]，还能减少温室气体的排放[7-8]；混入辣木叶还可以提高豆科饲草的青贮品质[9-10]。然而，辣木叶青贮发酵过程中有超过一半的蛋白质发生降解，这可能会降低动物氮素利用效率，导致氮排放增加。

黄梁木（Neolamarckia cadamba），又称团花树，是茜草科团花属一种大型落叶速生热带树种，在我国主要分布在广东、广西、云南等省区，同时也是热带和亚热带地区新兴的一种木本饲料植物，具有生长速度快、单位产量高和生物活性丰富的特点[11-12]。黄梁木叶具有较高的饲用价值和较好的青贮品质[11，13]，并且在青贮发酵过程中蛋白质水解程度很低，这可能与其含有丰富的单宁和独特的蛋白酶活性有关[11，14]；混入一定比例黄梁木叶可显著降低豆科青贮饲料非蛋白氮和氨态氮的含量[15]。

混入辣木叶或黄梁木叶可以一定程度改善常规牧草青贮的发酵品质和营养保存，但两种材料在青贮发酵上是否存在协同作用尚不清楚，适宜混合比例仍不明确。因此，在本研究中，将新鲜的辣木叶和黄梁木叶按一定比例混合青贮(100∶0、75∶25、50∶50、25∶75、0∶100，鲜样基础)，并在青贮发酵的第3、7、14、30 天取样，分析青贮发酵品质、氮组分、蛋白酶活性等指标，以研究这两种木本饲料在青贮发酵方面的组合效应。

1 材料与方法

1.1 原料准备与青贮制作

从试验田人工采集新鲜的辣木嫩枝叶和黄梁木叶，在实验室用铡草刀分别将其剪碎至1～2 cm，然后按一定鲜样比例（100∶0、75∶25、50∶50、25∶75 和0∶100）称取两种原材料进行复配，每份总量200 g鲜重，每个复配比例称取12 份，分别混合均匀后装入实验室用聚乙烯青贮袋（20 cm×30 cm），用家用食品真空封口机抽气密封，准确称量记录每袋青贮的初始重量后避光室温存放。整个试验共制备60 份袋装青贮（5个混合比例×4个采样时间点×3个重复），分别在青贮发酵第3、7、15、30 天，每个复配比例随机挑选3 袋青贮开封取样，每袋青贮取样一式三份，每份20 g，分别用于微生物数量平板计数、pH 和有机酸、蛋白酶活性检测，余下青贮烘干用于养分分析。此外，每次开封前称量每袋青贮重量，根据青贮前后的质量差估算青贮干物质损失。

1.2 青贮微生物数量、发酵参数、蛋白质组分和蛋白酶活性检测

试验流程参照He 等[14]。取一份20 g 样品加入180 mL 灭菌生理盐水浸提，置于摇床上低速摇荡30 min，浸提液10×梯度稀释，分别用MRS 培养基、结晶紫中性红胆盐琼脂培养基和孟加拉红培养基进行乳酸菌、大肠杆菌、酵母菌和霉菌培养，放置在普通培养箱30 ℃培养，3 d后挑选菌落数为30～300之间的平板进行菌落计数。另取一份20 g 样品加入180 mL 纯化水浸泡，置于4 ℃冰箱中过夜，随后用定性滤纸过滤，收集滤液用于测定pH、氨态氮和有机酸的含量。其中，pH 测定用便携式玻璃电极pH 计（PHS-3C，上海雷磁仪器有限公司），氨态氮含量检测采用苯酚-次氯酸钠法[16]，有机酸含量分析采用高效液相色谱法（岛津LC-14型，日本）。此外，取20 g青贮样品，加入100 mL 预冷磷酸钠缓冲液后进行匀浆处理，过滤收集滤液，采用Guo 等[17]和Feller 等[18]的方法测定酸性蛋白酶、羧肽酶和氨基肽酶的活性。剩余的青贮饲料转移到牛皮纸大信封袋中，置于65 ℃烘箱中干燥48 h，测定干物质含量，最后将烘干样粉碎过1 mm筛，参照Licitra 等[19]的方法分析青贮蛋白质组分（粗蛋白质、真蛋白质、非蛋白氮），其中氮含量采用凯氏定氮法（Kjeltec 2300，FOSS）测定，粗蛋白含量通过N 含量×6.25计算。

此外，借鉴饲料间组合效应评价方法，通过组合效应指数合理评估两种原料混合青贮的组合效应，以期筛选出最佳的复配比例。组合效应指数计算公式参照王旭[20]。

单项组合效应指数（SFAEI）=（组合后实测值-加权估算值）/加权估算值

式中：综合组合效应指数——各单项组合效应值之和。

1.3 数据统计分析

所有数据均使用SAS 9.2 软件的GLM 程序进行双因素方差分析，同时采用正交多项式对混合比例的线性和二次响应结果进行评估。采用Duncan’s 检验法进行多重比较，P＜0.05 为差异显著，P＜0.01 为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 辣木叶和黄梁木叶的原料特性

新鲜辣木叶和黄梁木叶的干物质、蛋白质组分和微生物数量的分析结果见表1。新鲜辣木叶和黄梁木叶的干物质含量分别为21.73%、23.81%，蛋白质含量分别为21.25%、11.45%，真蛋白比例分别为81.28%和88.91%，且两种原料间以上指标存在极显著差异（P＜0.01）。新鲜辣木叶和黄梁木叶的乳酸菌数量分别为3.93、4.14 lg CFU/g FM，大肠杆菌数量分别为4.30、4.80 lg CFU/g FM，酵母菌和霉菌数量均少于4.00 lg CFU/g FM。

表1 新鲜辣木叶和黄梁木叶的蛋白质组分和微生物组成

2.2 辣木叶与黄梁木叶混贮的发酵品质

辣木叶与黄梁木叶混贮的发酵特性参数如表2所示。随着黄梁木叶含量的增加，混合青贮的干物质含量随之增加（T：P＜0.01；L：P＜0.01，Q：P＜0.01）。在青贮发酵过程中，干物质损失逐渐增加（D：P＜0.01）；与辣木叶青贮、黄梁木叶青贮相比，混合青贮的干物质损失较小（T：P＜0.01；L：P＜0.01；Q：P＜0.01）。与辣木叶青贮相比，混合青贮3 d 的pH 较低，但随后相对更高（D：P＜0.01），最终所有青贮饲料的pH 均低于4.20。随着黄梁木叶含量的增加，混合青贮的乳酸菌数量、乳酸和乙酸含量逐渐降低（T：P＜0.01；L：P＜0.01，Q：P＜0.01）。此外，与辣木叶青贮、黄梁木叶青贮相比，混合青贮的酵母菌和大肠杆菌的数量较多（T：P＜0.01）。

表2 不同比例辣木叶与黄梁木叶混贮的发酵特性

2.3 辣木叶与黄梁木叶混贮的蛋白质组分

辣木叶与黄梁木叶混贮的蛋白质含量及各组分比例见表3。随着黄梁木叶含量的增加，混合青贮的蛋白质含量、非蛋白氮比例和氨态氮比例均降低（T：P＜0.01；L：P＜0.01，Q：P＜0.01），而真蛋白比例增加（T：P＜0.01；L：P＜0.01，Q：P＜0.01）。在青贮发酵过程中，青贮饲料的真蛋白质比例逐渐降低（D：P＜0.01），非蛋白氮比例和氨态氮比例增加（D：P＜0.01）。与辣木叶青贮相比，混合青贮和黄梁木叶青贮的氨态氮比例极显著降低（T：P＜0.01）。

表3 不同比例辣木叶与黄梁木叶混贮的蛋白质组分

2.4 辣木叶与黄梁木叶混贮的蛋白酶活性

辣木叶与黄梁木叶混贮的蛋白酶活性如表4 所示。在青贮发酵过程中，青贮饲料中的羧基肽酶、氨基肽酶和酸性蛋白酶的活性逐渐增强（D：P＜0.01），特别是在青贮发酵14 d以后。与辣木叶青贮相比，黄梁木叶青贮和混合青贮的三种蛋白酶的活性均较高（T：P＜0.01），并随着黄梁木叶含量的增加，混合青贮的氨基肽酶和酸性蛋白酶的活性线性增加（T：P＜0.01；L：P＜0.01）。

表4 不同比例辣木叶与黄梁木叶混贮的蛋白酶活性(U/g DM)

2.5 辣木叶与黄梁木叶混贮的组合效应

辣木叶与黄梁木叶混贮在青贮发酵参数、蛋白组分和蛋白酶活性的组合效应指数如表5 所示。辣木叶与黄梁木叶混贮在青贮干物质损失、乳酸和乙酸含量、非蛋白氮和氨态氮比例的单项组合效应指数均为负值，且不同比例混贮在干物质损失和氨态氮比例的组合效应指数存在极显著差异（P＜0.01）；25%、50%和75%黄梁木叶比例混贮的多项组合效应指数（负向）依次为-1.82、-1.47 和-2.68。辣木叶和黄梁木叶混贮在pH 和蛋白酶活性（氨基肽酶、羧基肽酶、酸性蛋白酶）的单项组合效应值上均为正值，且不同比例混贮的效应指数存在显著差异（P＜0.05），不同比例混贮的多项组合效应指数（正向）依次为3.83、1.60 和0.49。

表5 辣木叶和黄梁木不同比例混贮的组合效应指数

3 讨论

3.1 辣木叶和黄梁木叶的原料特性

在本研究中，辣木叶和黄梁木叶的干物质含量远低于优良青贮饲料的理想干物质含量（30%～35%），这可能不利于青贮生产[21]。研究表明，除了潜在的流出损失外，较高的水分会稀释营养物质的浓度，特别是水溶性碳水化合物的浓度，并有利于植物酶和梭状芽孢杆菌等微生物的活动，抑制青贮pH 快速下降，最终导致显著的营养损失和蛋白质水解[14-15]。与真蛋白质利用效率相比，反刍动物对非蛋白氮的利用效率相对较低，因此真蛋白质比例可作为反映蛋白质饲料质量的一个简单指标[14，22]。尽管辣木叶和黄梁木叶的粗蛋白含量相差较大，但它们均含有较高比例的真蛋白质，这与He 等[14]和Wang 等[23]报告的数据一致。除营养组成外，附生微生物菌群是影响青贮发酵的另一个重要因素。研究显示，青贮时乳酸菌初始数量大于5.0 lg CFU/g FM 是制作优良青贮的必要条件[24]，因此，单独青贮辣木叶或黄梁木叶的难度较大，特别是这两种原料中大肠杆菌的数量多于乳酸菌。

3.2 辣木叶与黄梁木叶混贮的发酵品质

混贮干物质含量随着黄梁木叶含量的增加而增加，因为黄梁木叶原料干物质含量高于辣木叶。与辣木叶或黄梁木叶青贮相比，混合青贮的干物质损失较小，这表明辣木叶和黄梁木叶青贮具有协同效应。鉴于水分是影响酶和微生物活性的关键因素，因此混贮可能在一定程度上有助于减少干物质损失。Wang等[15]报道，混合黄梁木叶减少了柱花草青贮和苜蓿青贮的干物质损失，可能得益于黄梁木叶的抗菌活性。本研究中所有青贮的最终pH 均低于优良青贮的基准pH（4.20）[22]，说明辣木叶和黄梁木叶单独或混合青贮都可以达到理想的pH。原料的含糖量、缓冲能力和细菌群落等因素差异都可能造成青贮pH 不同。青贮过程中pH 的下降由乳酸菌发酵产生的有机酸引起[14]，与黄梁木叶青贮相比，辣木叶青贮中的乳酸和乙酸含量都较高，这可能源于二者水溶性碳水化合物含量或抗菌活性的差异。本试验中，混合青贮的酵母菌数量在青贮发酵的前14 d 有所增加，但在之后便下降到一个相当低的水平。这可能与青贮初期的pH 较高和乙酸含量较低有关，乙酸是众所周知的抗真菌剂，而较低的pH 条件有助于抑制微生物生长[25]。综上所述，辣木叶与黄梁木叶混贮可能通过抑制细菌发酵来减少辣木叶和黄梁木叶青贮的干物质损失。

3.3 辣木叶与黄梁木叶混贮的蛋白质组分

青贮过程中的蛋白质水解可以分为两个阶段，蛋白质首先在植物蛋白酶作用下水解产生游离氨基酸和肽，接着在微生物的作用下进一步脱氨产生酰胺、胺和氨等产物[14,26]。在本研究中，由于辣木叶和黄梁木叶中粗蛋白含量的差异，混合青贮的粗蛋白含量随着黄梁木叶含量的增加而降低。青贮过程中，辣木叶青贮的蛋白质被大量水解，而黄梁木叶青贮的蛋白质仅有少量被水解，与之前的研究一致[14]。这可能是因为黄梁木叶丰富的单宁对蛋白质的保存起到帮助作用[15]。因此，随着黄梁木叶含量的增加，混合青贮饲料中的真蛋白比例增加（最优比例为75%），非蛋白氮比例显著降低。这意味着，混合黄梁木叶可以提高辣木叶青贮的蛋白质质量，从而减少氮的排泄和对环境的影响。与非蛋白氮相比，氨态氮是更能反映氨基酸或多肽脱氨程度的指标[26]。由于氨态氮的利用效率低于真蛋白质，且氨态氮含量过高会对动物采食量产生负面影响[27]，因此一般建议青贮氨态氮比例小于总氮10%，最好低于5%[28]。在本研究中，辣木叶青贮的氨态氮比例远高于黄梁木叶青贮。这意味着，辣木叶青贮中参与氨态氮生成的微生物活性可能更强。即便如此，所有青贮饲料中的氨态氮比例处在较低的水平，这说明大部分非蛋白氮是多肽和游离氨基酸。综上所述，将辣木叶与黄梁木叶混贮可以降低其非蛋白氮的含量并提高真蛋白质含量，改善混合青贮中蛋白质的保存。

3.4 辣木叶与黄梁木叶混贮的蛋白酶活性

从辣木叶青贮和黄梁木叶青贮的蛋白质组分和蛋白酶活性的比较关系来看，蛋白酶活性的差异可能不是导致辣木叶青贮和黄梁木叶青贮的蛋白质组分差异的主要影响因素。单宁结合导致的蛋白质可及性降低可能是造成黄梁木叶青贮蛋白质水解受限的原因。研究表明，黄梁木叶含有较高含量的可水解单宁（＞4% DM）和缩合单宁（＞6% DM）[11,15]，并且大多数可提取的缩合单宁会在青贮过程中转化为蛋白质结合或纤维结合的缩合单宁[29]。此外，酸性蛋白酶的活性远高于羧基肽酶和氨基肽酶，这可能与它们最优pH（4.5、7.0、7.0）的差异密切相关[14,30]。综上所述，混合黄梁木叶可以改善辣木叶青贮饲料的蛋白质组分，但这并不是主要通过抑制蛋白酶的活性而达到的，其原因有待进一步研究。此外，黄梁木叶这种蛋白质保护作用可能会对动物体内氮的利用产生影响，甚至对其他营养物质的消化产生影响，值得继续关注研究。

3.5 辣木叶与黄梁木叶混贮的组合效应

通常，我们根据发酵参数、养分保存的各项指标对青贮品质优劣进行评判，相对较好的青贮应该是有机酸含量较高而pH 较低，蛋白质降解少（真蛋白比例高而氨态氮比例低），营养保存好而干物质损失少。由于原料特性的差异，不同原料混合青贮可能存在正向或负向协同效应。本研究中，辣木叶与黄梁木叶混贮在青贮干物质损失、乳酸和乙酸含量、非蛋白氮和氨态氮比例等指标上存在负向组合效应，尤其在干物质损失和氨态氮比例，数值越低越好，基于这些指标的多项组合效应指数判断，辣木叶与黄梁木叶混贮中黄梁木叶比例为75%时青贮效果较好。同时，辣木叶和黄梁木叶混贮在pH 和蛋白酶活性（氨基肽酶、羧基肽酶、酸性蛋白酶）存在正向组合效应，这4 个指标越低对青贮营养保存越有利，因此基于这些指标的多项组合效应指数判断，多项组合效应指数较低的混贮质量较好（黄梁木叶比例为75%的混贮）。综上所述，基于组合效应指数评估，辣木叶与黄梁木叶混贮的最适比例为25∶75。

4 结论

本研究结果显示，相对于辣木叶单独青贮，辣木叶与黄梁木叶混贮降低了青贮的干物质损失以及乳酸、乙酸、非蛋白氮和氨态氮含量，提高了氨基肽酶、羧基肽酶和酸性蛋白酶活性，综合评估以25∶75 比例混合效果最好。这些结果说明，辣木叶与黄梁木叶混贮有利于青贮过程中干物质和蛋白质的保存，且这种组合效应可能是由于微生物活动受到抑制而非蛋白酶活性变化造成的。