附子中内源性组分新乌头碱的毒性作用

陈锦萍,徐梦佳,郭 娴,万益群,郭 岚

(南昌大学化学化工学院,江西 南昌 330031)

乌头的侧根,在中国被称为“附子”[1],为毛茛科植物乌头(AconitumcarmichaeliiDebx)的子根加工品[2],主要分布于四川、陕西、甘肃等地[3-5]。附子味辛、甘,性大热,具有回阳救逆,补火助阳,散寒止痛等功效[6],在我国已有几千年的医用实践。《神农本草经》中记载:附子主治风寒咳逆,邪气,温中,金创,破徵坚积聚,血瘕,寒湿,痿躄,拘挛,膝痛不能步行。现代药理学研究表明,附子具有强心、抗心律失常等作用[7]。附子中含有乌头类生物碱、黄酮以及多糖等多种组分,其中,乌头碱、新乌头碱、次乌头碱等乌头生物碱是其重要的内源性组分[8],具有镇痛[9-10]、抗炎[11-13]、抗癫痫、抗抑郁、抗痴呆[14]抗肿瘤[15-16]、抗病毒[17]、提高免疫功能[18]等多种生理活性。

附子也具有一定的毒性,且安全系数窄,其治疗剂量接近于中毒剂量。有报道称,全球范围内由附子引起的中毒病例已超过5000例,因此附子的安全性也受到了高度关注。有研究表明,乌头碱、次乌头碱以及新乌头碱等双酯型乌头生物碱是其主要的毒性成分[19]。Ye qiang等[20]研究了3种双酯型乌头碱(乌头碱、新乌头碱、次乌头碱)和3种单酯型乌头碱(14-α-苯甲酰乌头碱、14-α-苯甲酰新乌头碱、14-α-苯甲酰次乌头碱)对斑马鱼胚胎的生物效应,发现双酯型乌头碱的心脏毒性、器官毒性以及功能毒性均比单酯型乌头碱强。雷怀成[21-24]等发现乌头碱在给药后短时间内,会导致脑神经细胞、心肌细胞、肝细胞、肾小管上皮细胞的凋亡数量明显增加。Gao等[25]研究认为乌头碱能通过部分线粒体依赖性凋亡途径诱导H9c2心肌凋亡。都姣娇等[26]报道了心肌细胞的存活率会随着次乌头碱浓度的升高而下降。目前,附子中的乌头碱以及次乌头碱的毒性研究较多,而结构与乌头碱和次乌头碱有一定差别的新乌头碱毒性评估报道较少,且主要集中在心肌细胞层面[27-28]。同时,毒性评估的方法和方案也不统一,导致结论有偏差。基于此,本文选择新乌头碱为研究对象,以SD大鼠为模型动物,依据《食品安全国家标准-急性经口毒性试验》(GB 15193.3-2014)中的霍恩氏法,开展新乌头碱对大鼠的急性经口毒性评价,并探究新乌头碱对于大鼠的主要脏器(包括心脏、肝脏以及肾脏)的毒性作用,为附子的安全使用提供一定的科学依据。

1 实验部分

1.1 主要试剂与材料

新乌头碱(纯度≥99.47%,购自广东隽沐生物科技股份有限公司);玉米油(食品级);苏木素-伊红染液购自武汉市皮诺飞生物科技有限公司;10%福尔马林中性固定液购自南昌雨露实验器材有限公司;BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术有限公司;丙二醛(MDA)试剂盒和磷酸盐缓冲液(PBS)购自白鲨生物科技有限公司;脂质过氧化物(LPO)和诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)试剂盒购自南京建成科技有限公司。

1.2 主要仪器与设备

JJ-12J型脱水机、JB-B5型包埋机JB-L5型冻台均购自于武汉俊杰电子有限公司;RM2016型病理切片机购自于上海徕卡仪器有限公司;KD-P型组织摊片机购自于浙江省金华市科迪仪器设备有限公司;DHG-9140型烤箱购自上海慧泰仪器制造有限公司;10212432C型载玻片及盖玻片购自于江苏世泰实验器材有限公司;NIKON ECLIPSE CI型正置光学显微镜和NIKON DS-U3型成像系统均购自日本尼康有限公司;CL-21M型冷冻离心机购自上海卢湘仪离心机仪器有限公司;E-330全波长多功能酶标仪购自美国Thermo公司。

1.3 实验动物

SPF级SD大鼠50只,雌雄各半,体重为180～220 g。大鼠由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供,实验单位使用许可证编号为SYXK(赣)2015-0001,动物许可证号为SCXK(湘)2019-0004。给药前,所有大鼠在试验环境中进行5 d环境适应,环境温度为24 ℃±2 ℃,相对湿度50 % ± 10 %,按性别分笼饲养,试验期间喂基础饲料,饲料由湖南嘉泰实验动物有限公司提供,饲料许可证号为SCXK(湘)2020-0006,自由饮水。

1.4 实验方法

1.4.1 动物给药

SPF级SD大鼠50只,按性别随机分成10组,雄性和雌性均分为1个对照组和4个给药组,每组5只。给药组灌胃新乌头碱,雄性给药组剂量分别为1.00、2.15、4.64、10.0 mg·kg-1,雌性给药组剂量分别为0.464、1.00、2.15、4.64 mg·kg-1,对照组灌胃相同体积的食用级玉米油。以上各组大鼠均按体质量10 mL·kg-1一次性经口灌胃。灌胃前大鼠禁食16 h左右,自由饮水,灌胃后,禁食3～4 h。之后自由饮食和饮水,持续观察14 d。

1.4.2 临床观察

连续14 d观察大鼠的毛发、眼部、皮肤、活动状态以及精神状态。在实验开始前以及实验结束后称大鼠的体重,并且每周称1次体重。观察期内若发现动物死亡,立即解剖,肉眼观察其心脏、肝脏以及肾脏病理形态变化,并记录各组死亡大鼠数量。

1.4.3 脏器指数的测定与分析

14 d实验结束后,对所有大鼠进行处死解剖,取心脏、肝脏以及肾脏并且称重,计算各大鼠各个器官的脏器指数(脏器指数=脏器重量/体重*100 %)。

采用SPSS26.0软件分析脏器指数的数据。用单因素方差分析法(ANOVA)分析两组间脏器指数数据的差异性。根据最小显著性差异法(LSD),P<0.05为具有显著性差异,其中,P<0.01为差异十分显著。

1.4.4 组织病理学分析

将解剖的心脏、肝脏、肾脏称重后用10 %的福尔马林固定液固定24 h以上后,经过乙醇梯度脱水,石蜡包埋,切片机切片,苏木素-伊红(HE)染色等一系列程序后,在光学显微镜下进行病理组织形态学研究。

1.4.5 氧化应激能力指标的测定

将解剖的大鼠肝脏、肾脏称重后于-80 ℃冷藏24 h以上,之后取一定量的肝脏组织和肾脏组织,与一定比例的磷酸盐缓冲溶液(PBS)混合研磨后,按试剂盒规定的转速,在4℃条件下离心,取上清液。接着使用相关试剂盒测定肝脏和肾脏的诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)、肾脏的脂质过氧化物(LPO)以及肝脏的丙二醛(MDA),之后采用SPSS26.0软件分析氧化应激能力指标的数据。

2 结果与讨论

2.1 大鼠的一般状况

对于雄性大鼠,大部分低剂量给药组(1.00、2.15 mg·kg-1)的大鼠在给药24 h之内表现出呆滞、嗜睡、食欲下降等症状。少部分还出现震颤、惊厥、流涎、痉挛、叫声异常、昏迷、体位异常、流泪、鼻翼扇动竖毛等现象。24 h过后,除了个别表现呆滞的,其余皆恢复正常,食欲增加,此两个剂量的大鼠无死亡。而中高剂量组(4.64、10.0 mg·kg-1)的大鼠给药后2 h内5只大鼠皆不同程度地出现与低剂量给药组(1.00、2.15 mg·kg-1)一样的中毒症状,小部分还出现眼睛和鼻孔出血、流泪、抽搐。在给药4 h内,这两个给药组大鼠相继全部死亡。各组大鼠死亡数如表1所示。

对于雌性大鼠,给药剂量为0.464 mg·kg-1的大鼠在给药6 h之内出现昏睡、呆滞、震颤、心跳异常,食欲下降,其中1只出现流涎和冷汗。8 h之后开始恢复正常,此剂量无大鼠死亡。剂量为1.00 mg·kg-1的大鼠在给药24 h之内表现出呆滞、嗜睡、食欲下降等症状,少部分还出现流涎、痉挛、叫声异常、昏迷、体位异常、流泪、鼻翼扇动、竖毛、冷汗、腹泻、眼睛以及鼻孔出血等现象。24 h过后恢复正常,食欲增加,此剂量组有1只大鼠死亡。对于剂量为2.15和4.64 mg·kg-1的大鼠给药后4 h内5只大鼠皆不同程度地出现震颤、惊厥、不安、痉挛、呆滞、嗜睡、昏迷、体位异常、叫声异常、竖毛、冷汗、鼻翼扇动、抽搐。一部分出现流涎、腹泻、眼睛以及鼻孔出血等现象。在给药8 h内,全部动物相继死亡。各组大鼠死亡数如表2所示。解剖实验中死亡的大鼠,肉眼可见其心脏颜色变黑变暗甚至有变硬现象,而肝脏和肾脏未见有明显的改变。初步判断,新乌头碱在短时间内会对大鼠的心脏以及神经系统造成明显的作用。有研究报道乌头类生物碱对迷走神经有强烈的兴奋作用,释放出乙酰胆碱作用于心脏,极易形成室性混乱性心律,如室早、室速甚至室颤[29],也有文献指出双酯型乌头生物碱可使心肌细胞内Ca2+稳态失衡,从而引起心律失常[30,31]。本实验观察到的现象说明新乌头碱可能与其它乌头类生物碱一样,会影响大鼠的神经系统和心脏功能。

给药组的雄性大鼠和雌性大鼠的死亡数分别见表1和表2,依据《食品安全国家标准-急性经口毒性试验》(GB 15193.3-2014)中LD50的测定方法,得出雄性大鼠的LD50约为3.16 mg·kg-1,雌性大鼠的LD50约为1.26 mg·kg-1。可以看出雄性比雌性的耐受性更强,造成这种差异的原因可能是与不同性别大鼠的身体组成、激素、肝脏代谢、肾脏清除能力、蛋白质结合与分布的差异有关[32-33]。

表1 雄性大鼠各给药组的死亡数Tab.1 Death number of male rat dose group

表2 雌性大鼠各给药组的死亡数Tab.2 Death number of female rat dose group

2.2 新乌头碱对大鼠体重的影响

在14 d的观察期内,存活下来的各个剂量组的大鼠平均体重变化趋势见图1。由图中可以看出,雄性大鼠给药组和雌性大鼠给药组的体重变化趋势与各自的对照组相比,均无明显差异。这说明单次给药,如果大鼠能够存活下来,新乌头碱对大鼠的生长没有显著影响。

t/d

2.3 新乌头碱对大鼠脏器指数的影响

脏器指数是指实验动物的某个脏器与其体重的比值,是毒理学实验中常用的指标。当动物的脏器因染毒受损后,其脏器的重量也往往随之改变,从而引起了脏器指数的变化。一般来说,脏器指数增大,则提示着脏器充血、水肿或增生肥大等;而脏器指数减小,则提示着脏器萎缩、缺血、发育不良等变化。本实验用脏器指数来研究新乌头碱对大鼠心脏、肝脏、肾脏的影响,结果见表3。雌雄大鼠各给药组的肝脏指数和肾脏指数与对照组相比不具有显著性差异(P>0.05);雄性2.15 mg·kg-1组的心脏指数与对照组相比差异十分显著(P<0.01),而雌性0.464 mg·kg-1组和1.00 mg·kg-1组的心脏指数与对照组相比具有显著性差异(P<0.05)。初步表明了新乌头碱对大鼠的心脏有明显的影响,并且对雌性大鼠的影响更明显。

表3 新乌头碱对大鼠脏器指数的影响
Tab.3 Effect of mesaconitine on organ coefficient of rats

剂量组心脏指数/g(100 g)-1肝脏指数/g(100 g)-1肾脏指数/g(100 g)-1雄性对照组0.38±0.01a3.79±0.200.45±0.01雄性1.00 mg·kg-10.42±0.073.91±0.550.42±0.03雄性2.15 mg·kg-10.49±0.07∗∗3.67±0.260.42±0.01雌性对照组0.32±0.063.67±0.450.41±0.02雌性0.464 mg·kg-10.41±0.07∗4.05±0.380.41±0.05雌性1.00 mg·kg-10.40±0.05∗3.60±0.160.40±0.03

*表示与对照组比较,差异具有显著性(P<0.05),**表示与对照组比较,差异十分显著(P<0.01)。a:表示平均值±标准偏差。

2.4 组织病理学分析

通过光学显微镜对大鼠的心脏、肝脏和肾脏的病理切片进行分析,结果如图2～4所示。由图2可知,与对照组相比,各给药组雌雄大鼠心脏心肌细胞水肿,间质血管扩张充血。由图3可知,各给药组雌雄大鼠肝脏有脂肪空泡或变性,并且有肝细胞坏死,雄性2.15 mg·kg-1组和雌性1.00 mg·kg-1组大鼠肝脏的汇管区见炎细胞浸润。由图4可知,

(a:雄性对照组;b:雄性1.00 mg·kg-1组;c:雄性2.15 mg·kg-1组;d:雌性对照组;e:雌性0.464 mg·kg-1组;f:雌性1.00 mg·kg-1组)。

各给药组大鼠肾脏都存在着肾小管水肿,肾间质血管扩张充血,并且雄性各给药组大鼠肾脏出现部分肾小球纤维组织增生,雌性0.464 mg·kg-1组大鼠肾脏出现少量炎细胞浸润。病理组织学分析结果表明,一定剂量的新乌头碱会对大鼠肝脏造成一定的损伤。

2.5 新乌头碱对大鼠脏器氧化应激能力的影响

iNOS能够诱导机体产生NO,当机体NO浓度太高时,会对机体造成损伤。LPO和MDA经常被作为脂质过氧化的指标,脂质过氧化会对细胞产生毒害作用,组织中LPO以及MDA的含量越高,提示着组织的损伤越大。根据组织病理学结果,本实

表4 新乌头碱对大鼠氧化应激能力的影响Tab.4 Effect of mesaconitine on oxidative stress capacity of

*表示与对照组比较,差异具有显著性(P<0.05),**表示与对照组比较,差异十分显著(P<0.01)。a:表示平均值±标准偏差。

验通过测定肝脏和肾脏的氧化应激能力的指标来研究新乌头碱对大鼠肝脏、肾脏的影响,结果见表4。各给药组雌雄大鼠的肝脏MDA指标、肾脏iNOS指标以及肾脏LPO指标与对照组大鼠相比不具有显著性差异(P>0.05)。雌性1.00 mg·kg-1组大鼠和雄性1.00 mg·kg-1组大鼠的肝脏iNOS指标与雌雄对照组大鼠相比具有显著性差异(P<0.05),而雄性2.15 mg·kg-1组大鼠的肝脏iNOS指标与雄性对照组大鼠相比差异十分显著(P<0.01)。表明了一定剂量的新乌头碱对大鼠的肝脏有明显的损伤。

3 结论

本文通过14 d急性经口毒性实验,探讨了附子中内源性组分新乌头碱的生物效应,得到新乌头碱对雄性大鼠和雌性大鼠的LD50分别为3.16和1.26 mg·kg-1,表明新乌头碱对生物具有较强毒性。病理组织学分析结果表明,一定剂量的新乌头碱会对大鼠肝脏造成一定的损伤,氧化应激能力指标也进一步验证了一定剂量的新乌头碱的确会对大鼠肝脏造成损伤。因此,在使用附子时要注意其剂量以及使用周期。