亚硝酸盐对鲆鲽类急性毒性影响研究进展

葛伟宏 赵心冉 刘栩华 吉 情 李云婷 曹 梅* 王兴强于佳辰 于润川

（1江苏海洋大学海洋科学与水产学院，江苏连云港 222005；2连云港海之源水产育苗有限公司，江苏连云港 222005）

鲆鲽类是一种富含多种营养成分的鱼类，因它含有人体所需要的元素，且肉质鲜美、口感细腻，目前已成为中国人民餐桌上常见的食物。同时，鲆蝶类生长速度快、食性广、养殖周期短、效益高的特点，已使其成为中国海水养殖业中最具有代表性的产业之一。亚硝酸盐是水生环境常见污染物，对水生生物具有毒性。鲆鲽类在国内外的水产养殖中占有重要地位，被广泛集约化养殖。本文总结了亚硝酸盐的来源、毒性机理以及其对水产养殖生物的危害，综述了硝酸盐对鲆鲽类组织器官、应激反应、生理功能、免疫应答以及细胞凋亡方面的影响。[1]。

1 亚硝酸盐的来源和毒性机理

亚硝酸盐（NO2-）是水生环境中常见的污染物，对水生生物具有毒性。在天然水体中，亚硝酸盐浓度通常低于0.1 mg/L。鲆鲽类主要在室内水池中进行高密度养殖及生产，养殖系统包括再循环和流经系统，其中海水经常被重复利用以节省能源，水质情况是影响鱼类品质和生产水平的最重要因素之一[2-3]，因此有必要对此进行严格的水质控制。水体生态正常时，亚硝酸盐等有害物质可以通过硝化细菌的作用被转化为无毒的物质，或者被水中藻类生物利用变成无毒的氮气。这样可以使水体环境处于自净平衡的状态。然而，当水体中污染物超过了水体自我净化的能力时，水质恶化。这会增加水中有害物质的含量，对水生生物健康产生威胁，影响水体生态平衡。

亚硝酸盐对动物的致毒机理：①亚硝酸盐会影响鱼、虾、蛙等动物体内的抗氧化酶活性，溶菌酶的活力和脾细胞的呼吸爆发力，从而降低动物的免疫能力；②亚硝酸盐还会将动物体内血红蛋白球中的血红蛋白转化为高铁血红蛋白，从而导致组织内缺氧，细胞膜的通透性改变，组织自溶性提高以及组织坏死等病理现象。目前，亚硝酸盐对水生动物毒性效应方面的研究，多见于鱼、虾和鳖等[2]。

在海水鱼类中，亚硝酸盐摄取的途径已被证明发生在肠道和鳃上皮[3]。一些研究还发现，亚硝酸盐浓度过高会减缓海鱼的生长，扰乱离子平衡，并引起缺氧应激，但亚硝酸盐毒性的分子机制尚未完全了解[4]。关于亚硝酸盐对鲆鲽类以及整个鱼类的毒性机理研究一直在进行。

2 亚硝酸盐的主要协同因子

导致亚硝酸盐中毒的主要因子包括接触时间、电离强度、铁离子数量、pH 和溶氧浓度等。亚硝酸盐对鱼的毒性与接触时间有关。在接触时间不超过24 h 时，其半致死剂量（LD50/LCt50）通常高于最高值。但随着接触时间的延长，其毒性逐渐减弱。此外，相同含量的亚硝酸盐在中等分子强度的软水体中比硬水体毒性更强，在淡水中比在海水中毒性更强。水的离子种类也可以降低对亚硝酸盐的毒害，较高的氯离子浓度（盐浓度）能够显著减少亚硝酸盐对鱼类的侵害。而溴化物的分子也能以竞争通道的方式，从而抑制亚硝根物质渗透到鱼鳃的上表层细胞。较好的氯化物分子与亚硝根离子比率可抑制亚硝酸盐进入血液，从而减少其“表面上”的毒性。一般而言，当亚硝酸盐含量在39～436 mg/L时，而氯离子含量大约为10～190 mg/L 时，就可以减少亚硝酸盐的毒害。此外，碳酸根化合物虽然具有一个类似于与溴化物发生反应的功能，但是因为碳酸根离子的分子量较大，而无法有效地与亚硝根化合物竞争。控制水体的pH也有助于减少亚硝酸盐的毒性，主要因为pH能够反应亚硝酸盐在水中的溶解状态，其分子结构以及与其他分子结构之间的相互作用也取决于pH 而定。当pH 低于7 时，与亚硝酸根离子结合的H+会增加，因此生成亚硝酸元素的总量也就会增加。亚硝酸分子更易于透过鱼鳃的上皮细胞，之后更顺畅地进入到血液中，且不会被任何分子所阻滞。而水体中高含氧量也会降低亚硝酸盐的毒性，这是因为亚硝酸盐会降低向血液中运送氧气的功能。已有研究证实，在水域中高亚硝酸盐浓度的前提下，鱼类对氧的需要量将远高于在水域中亚硝酸盐浓度低的情况。

3 亚硝酸盐对鲆鲽类急性毒性影响

水体中亚硝酸盐浓度过高是对水生动物是有毒害的，生存和致死浓度50%（LC50）被认为是评估急性毒性的关键参数[3]。溶解氧、氨、亚硝酸盐等水质变化可能引起生物应激[4]。在大菱鲆（Scophthalmus maximus）中，亚硝酸盐的急性毒性已被报道，96 h中位致死浓度（LC50）为1.88 mmol/L，但在分子和生理水平上的后续影响未被描述[5]。此外，海水中亚硝酸盐暴露水平高于25 mg/L 则会影响褐牙鲆的抗氧化系统、神经递质和免疫反应。亚硝酸盐暴露水平高于25 mg/L 可以通过改变溶菌酶和IgM 活性来改变抗氧化酶（SOD、CAT、GST和GSH）的活性，以及神经递质AChE的活性和免疫反应[6]。

3.1 亚硝酸盐对鲆鲽类组织器官的影响

亚硝酸盐不仅在血液中能积累，在鳃、肝脏、大脑和肌肉组织中也会发生生物积累。硬骨鱼的鳃是一种多功能器官，可以进行离子运输、气体交换、酸碱调节和废物排泄。它是环境污染物的主要靶器官，被认为是鱼类吸收亚硝酸盐、Cu 和Zn 等污染物的主要部位[6-7]。因此，鱼鳃比其他器官更容易受到毒物的伤害。高浓度的亚硝酸盐会导致鳃的肥大、增生、上皮细胞坏死和渗透调节功能障碍。在鳃中，高浓度亚硝酸盐会引起氧化应激，导致抗氧化成分损失造成脂质过氧化[7]。目前，国内外研究者在亚硝酸盐暴露水平升高时对鱼类，特别是海鱼鳃的分子效应的研究很少。

3.2 亚硝酸盐对鲆鲽类应激反应的影响

鱼的应激反应是由外部环境的改变或暴露于有毒物质引起的，应激指标用于检测这些毒性效应[8]。高浓度的亚硝酸盐暴露会对鱼类造成相当大的应激，其毒性表现为生理变化、组织损伤和细胞损伤[9]。在各种应激指标中，葡萄糖浓度指标很重要，因为暴露于有毒物质的鱼类，其碳水化合物代谢的增加通常会导致葡萄糖浓度升高[10]。水生动物对葡萄糖和糖原的利用是一种解毒机制，在应激条件下，葡萄糖浓度通常会增加。血浆皮质醇是鱼类体内主要的类固醇激素，皮质醇的分泌通常受到各种应激源的刺激，如暴露于有毒物质和环境变化[11]。热休克蛋白（Heat shock proteins，HSPs）是由各种应激源诱导的应激蛋白，在亚硝酸盐环境中作为可靠的应激指标。许多研究认为热休克蛋白与细胞保护功能密切相关，它们在细胞和组织中的调节是一种应激反应[12-13]。

亚硝酸盐暴露通过引起氧自由基在体内积聚而诱发氧化应激。GST是一种与肝脏解毒有关的重要酶。该蛋白催化涉及GSH 的反应生成无毒或有毒的小GSH硫结合化合物，这些化合物与各种带正电的内源性或外源性物质反应，确保这些物质可以很容易地从胆汁或尿液中排出[14]。生物絮凝体和海水中亚硝酸盐暴露后，肝脏和鳃中的GST 活性均显著升高，这可能是由于亚硝酸盐暴露引起的抗氧化反应，以防止氧化应激[15]。暴露于亚硝酸盐的鳙鱼的GST 活性显著增加。谷胱甘肽系统（谷胱甘肽和谷胱甘肽二硫化物）在控制细胞氧化还原状态和维持细胞正常生理功能方面具有关键作用；鱼在氧化应激下，GSH 对外界刺激的敏感度降低[16]。亚硝酸盐暴露在生物絮团和海水中后，肝脏和鳃中的谷胱甘肽显著降低，有研究表明暴露于亚硝酸盐的鳙鱼肝脏中GSH的显著减少，GSH的减少是由于GSH氧化为GSSG，从而消除了ROS，这一过程是作为氧化应激的防御机制。此外，GSH 的还原与GST 活性密切相关，因为GST 通过结合亲电氧自由基催化GSH 的还原[17]。鱼类暴露于亚硝酸盐会导致细胞内ROS和RNS 的生成显著增加[18]。海水养殖中的褐牙鲆，在水体亚硝酸盐暴露后，显著改变了SOD、CAT、GST和GSH等抗氧化反应酶的活性，这种反应可能通过刺激抗氧化防御系统而发生[19]。

胆碱酯酶广泛存在于脊椎动物和无脊椎动物中，对乙酰胆碱酯酶活性的抑制被认为是一种可靠且精准的生物标志物，可用于评估暴露于毒物环境下鱼类的神经递质的毒性[20]。在生物絮凝体和海水中饲养的褐牙鲆（P.olivaceus）肝脏和鳃中的AChE 活性被水中亚硝酸盐暴露显著抑制[9]。暴露于高浓度亚硝酸盐的卡特拉魮（Catla catla）、亚洲野鲮（rohu）和麦瑞加拉鲮（Cirrhinus mrigala）大脑和肝脏中的AChE 活性显著降低[17]。进一步表明了暴露于亚硝酸盐的亚洲野鲮的大脑AChE 活性显著降低。这种AChE 活性的抑制是由于亚硝酸盐暴露应激引起的突触区域胆碱含量的增加，从而影响神经传递并引起神经毒性。

门诊、急诊就医病人人流量较大、病情复杂多变[3-6]、病人及其家属对医院服务需求和服务质量要求差异较大[7]，加之疾病谱变化，医疗保险制度改革，导致异地就医病人流动性增加，造成综合性医院志愿服务队伍人力资源合理配置难度增加。

亚硝酸盐暴露可诱发渗透调节毒性作用，如低钠血症、低氯血症、氯摄取抑制和鳃氯细胞衰竭，这些都是应激源，导致应激反应[21]。例如，血红蛋白转化为高铁血红蛋白（亚硝酸盐毒性的主要机制），这是一个高应激因子，因为它会诱导组织缺氧，而亚硝酸盐暴露会导致应激指标显著增加[22]。在这些胁迫指标中，血浆葡萄糖是评价胁迫的关键，因为该参数通常是通过环境胁迫诱导的糖异生作用而升高的[23]。在海水中的褐牙鲆的血浆葡萄糖浓度因水中亚硝酸盐的暴露而显著升高[24]。Roques等[25]发现暴露于亚硝酸盐的尖齿胡鲶（Claris gariepinus）的血糖浓度显著升高，这是由于密集的糖原分解和葡萄糖合成的升高。压力刺激儿茶酚胺分泌，反应增加糖原分解，从而升高血糖浓度[26]。此外，还报道了亚硝酸盐暴露导致大菱鲆幼鱼血糖浓度显著升高。皮质醇是鱼类的主要应激激素，受下丘脑-垂体-肾间轴（HPI）调节，在代谢中起重要的调节作用。皮质醇被认为是各种应激反应的标志，暴露于亚硝酸盐96 h 的露斯塔野鲮（Labeo rohita）的血清皮质醇显著增加。以及暴露于亚硝酸盐导致大菱鲆幼鱼血浆皮质醇浓度显著增加[7]。在鱼类中，应激诱导的血浆皮质醇或皮质类固醇的增加会刺激淋巴器官的淋巴细胞减少，应激诱导的血浆皮质醇增加对先天非特异性免疫防御机制的影响已得到证实[27]。有研究表明，在海水中褐牙鲆血浆皮质醇浓度因亚硝酸盐浓度升高而显著升高，这可能是由刺激下丘脑垂体肾间轴（HPI）引起的一般应激反应[24]。

众所周知，暴露于有机毒物和重金属的鱼类通过热休克蛋白控制应激反应，这与细胞保护功能有关，可以预防和修复蛋白质损伤。热休克蛋白在鱼的细胞和组织中被调节，作为亚硝酸盐暴露的应激反应[12]。HSP70因其对细胞凋亡的保护作用而被广泛研究[13]。许多研究表明暴露于亚硝酸盐的各种鱼类的HSP70显著增加，亚硝酸盐暴露引起鳃、肝脏和肾脏等组织损伤[28]。亚硝酸盐暴露也显著提高了生物絮凝体和海水中褐牙鲆肝脏和鳃中HSP70 的浓度[24]。

3.3 亚硝酸盐对鲆鲽类生理功能的影响

亚硝酸盐通常对水生生物有毒，并破坏一些生理功能。血液参数已用于评估鱼类的毒性作用[29]。亚硝酸盐暴露通过将血红蛋白转化为高铁血红蛋白影响鱼类血液生理，引起内源性一氧化氮产生等各种生理障碍，如炎症、离子失调、内分泌紊乱和排泄过程干扰等现象[21，25，30]。此外，亚硝酸盐暴露显著降低了在海水中饲养的褐牙鲆的血红蛋白和红细胞压积的血液学参数[24]。Svobodova 等[31]报道了鲤鱼（Cyprinus carpioL.）暴露于亚硝酸盐后血红蛋白的显著降低。Avilez 等[27]也报道了暴露于亚硝酸盐的石脂鲤（Brycon cephalus）的血红蛋白和红细胞压积显著降低。亚硝酸盐暴露导致溶血性贫血，由于NADH高铁血红蛋白还原酶降低了高铁血红蛋白的含量，增加了红细胞（RBCs）的能量需求，从而减少了红细胞在脾脏和肾脏代谢之前的循环时间。Costao 等[32]进一步研究点鳍红眼脂鲤（Colossoma macropomum）暴露于亚硝酸盐时红细胞压积和血红蛋白的显著降低。通过血红蛋白转化为高铁血红蛋白而减少血红蛋白是暴露于亚硝酸盐的鱼类的主要毒性作用，当这些鱼暴露于水中亚硝酸盐时，观察到灰鳍鲷（Sebastes inermis）的血红蛋白显著降低。类似的，Roques 等[25]发现暴露于亚硝酸盐的尖齿胡鲶（Clarias gariepinus）的血红蛋白也显著降低。

有机血浆中的胆固醇成分是细胞膜结构中的重要物质，也是所有类固醇激素的前体。毒性诱导的氧化应激通常会导致高胆固醇血症。然而，相关研究认为亚硝酸盐会减少鱼类体内类固醇激素的合成，这可能与亚硝酸盐向NO+的转变有关[30-33]。Das等[34]认为，在接触毒物的情况下，血浆蛋白浓度可能会因蛋白质分解代谢的增加而降低，以维持体内平衡，将血液中的结构蛋白转化为能量。Kim 等[24]的试验证明，海水养殖中的褐牙鲆，血浆胆固醇浓度因亚硝酸盐暴露而显著降低，这可能抑制了类固醇激素的合成，对褐牙鲆血浆总蛋白浓度无显著影响，所以亚硝酸盐暴露不影响褐牙鲆蛋白质分解代谢。

酶促血浆中的GOT 和GPT 已被广泛作为暴露于有毒环境所引起的肝损伤的指标[35]。海水养殖的褐牙鲆血浆中GOT 和GPT 浓度因水中亚硝酸盐浓度升高而显著升高，这可能是由于氮代谢紊乱引起的肝脏损伤所致。Hyun 等[36]研究了暴露于亚硝酸盐后，欧洲鳗鲡（Anguilla Anguilla）的GOT 和GPT 显著增加，并伴有肝坏死现象。以上表明，亚硝酸盐的暴露会影响海水养殖的鱼类的生产效率。

3.4 亚硝酸盐对鲆鲽类免疫应答的影响

环境变化往往会对鱼类造成压力，导致免疫力下降[37]。硬骨鱼具有各种重要的防御分子，如溶菌酶、补体和IgM，它们参与保护机体，使其免受潜在有害条件的侵害[38]。LYS 是一种阳离子酶，在防止鱼类感染革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌方面起着关键作用[39]。有研究表明亚硝酸盐暴露导致露斯塔野鲮的LYS 活性降低[40]。同时，LYS 基因在鳃组织中的表达也发生了类似的变化[41]。C3 和C4 是经典途径和凝集素途径的关键成分，负责各种免疫效应功能[42]。然而，补体的持续激活可能导致对宿主的不良反应和免疫抑制[43]。研究表明，环境污染物导致鱼类C3和C4基因或蛋白质上调[44]。鱼类有四类免疫球蛋白，它们是体液免疫系统的组成部分，包括IgM、IgD、IgT 和IgZ，由B 淋巴细胞分泌。在这些免疫球蛋白中，IgM 在鱼类的适应性免疫中具有关键功能，是评估鱼类免疫毒性的关键因素[45]。在鱼类中，一些研究报告了环境污染物，如硫酸铜、氨和二氧化碳，抑制了IgM 蛋白或mRNA 水平[46-47]。这些结果表明，亚硝酸盐引起了大菱鲆的免疫毒性和体液免疫抑制。

在鱼类中，2 个主要的HSP 家族是HSP70 和HSP90，它们被包括化学应激、热应激和拥挤应激的各种应激源诱导，并参与免疫反应[48-49]。鱼体内HSP70和HSP90水平的提高反映了蛋白质损伤或对后续应激耐受性的增强[50]。Jia 等[7，51]的研究表明，鳃中HSP70和HSP90基因的表达量随着亚硝酸盐浓度和暴露时间的增加而增加。这一结果与黄锡鲷（Sparus sarba）和团头鲂（Megalobrama amblycephala Yih）的研究一致。

鱼体内ROS 的大量产生会影响免疫力，并改变细胞结构，如脂质、膜、蛋白质和核酸[52]。鱼类的免疫系统对环境压力很敏感，免疫系统的变化被广泛认为是压力源的可靠指标。Miao[53]提示暴露于亚硝酸盐影响免疫反应，导致免疫抑制和免疫功能障碍。进一步表明毒性环境可影响水生动物的免疫反应。在鱼类体内的各种防御分子中，溶菌酶在保护鱼类免受细菌感染方面起着至关重要的作用。然而，亚硝酸盐暴露可引起溶菌酶活性的增加。海水养殖的褐牙鲆暴露于亚硝酸盐后血浆溶菌酶活性显著提高，这可能是由免疫系统刺激引起的。因此，在亚硝酸盐的环境胁迫下，鱼体内溶菌酶活性显著增加。

3.5 亚硝酸盐对鲆鲽类细胞凋亡的影响

一般来说，细胞外刺激，如生物、化学或物理因素，通过信号转导途径转导为细胞内反应，导致基因表达的变化[54]。亚硝酸盐不仅引起氧化损伤，还可能引发细胞凋亡[55]。细胞凋亡是一种高度组织化的细胞过程，伴随着大量细胞内蛋白酶和内切酶的激活。凋亡途径主要分为2 类：死亡受体介导的细胞凋亡途径和线粒体介导的细胞凋亡途径。内在和外在终点的共同事件是一组半胱氨酸蛋白酶（Caspases）的激活[56]。硬骨鱼的鳃是排泄、渗透调节和呼吸的多功能器官，与溶解毒物直接接触的面积较大。因此，鳃特别容易受到毒物的伤害。亚硝酸盐暴露会导致鳃肥大、增生、上皮细胞坏死和渗透调节功能障碍。在水生动物中，亚硝酸盐暴露也促进细胞凋亡。Sun 等[50]报道亚硝酸盐暴露诱导凋亡相关基因（Caspase-8 和Caspase-9）的转录，促进了斑头巨斑鱼幼鱼鳃细胞的凋亡。同样，在凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）、斑节对虾（Penaeus monodon）和罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergii）中也观察到亚硝酸盐诱导的血细胞凋亡[57-59]。然而，亚硝酸盐对海洋鱼类鳃细胞凋亡相关基因表达的影响的研究资料非常有限。

Caspases 是半胱氨酸蛋白酶，在细胞对不同刺激的凋亡反应中起着重要作用。许多研究表明亚硝酸盐可以通过Caspase 依赖通路诱导细胞凋亡[59]。Jia[7]发现亚硝酸盐胁迫下大菱鲆鳃中Caspases-3、-7和-9的mRNA 水平升高。基于上述结果，推测亚硝酸盐暴露通过激活大菱鲆的鳃中的启动子Caspase（Caspase-9）和效应子Caspase-3 和-7 来诱导细胞凋亡。

此外，亚硝酸盐暴露引起了凋亡相关基因的转录上调，表明Caspase 依赖通路的激活（图1）[7]。另外，亚硝酸盐暴露造成鳃细胞的凋亡与接触时间和浓度呈正相关。由于mRNA水平不一定能反映蛋白质水平和活性，亚硝酸盐诱导的细胞凋亡在今后的研究中需要在蛋白质水平上进一步评价。在血液中，亚硝酸盐暴露改变了离子稳态，有助于metHb的产生，从而导致应激反应和皮质醇、葡萄糖和热休克蛋白70 水平的升高。亚硝酸盐暴露引起鳃的氧化应激，引起脂质过氧化和抗氧化剂的损失。此外，亚硝酸盐诱导的氧化应激或NO 可能激活MAPK/JUK信号通路，增加P53 水平，触发Caspase 级联促进凋亡[7]。

图1 亚硝酸盐诱导大菱鲆毒性模型

4 研究与展望

随着养殖标准的日益提升以及养殖密度的日益增加，水域的养殖容量已到达甚至超过饱和水平，导致水域的生化状态日益下降，水域的氨氮含量、亚硝酸盐、硫化物等有毒、有害物质不断增加，养殖生物容易患病或者中毒致死，带来很大的风险。因此，对于亚硝酸盐对养殖生物的毒性危害问题的研究，必须从基础理论上入手，寻找多元化的解决方法。

一是选择一些同科（属）的养殖生物在同一试验环境下开展试验。例如：可以选择生活在同一水层，相同科（属）且规格一致的鱼开展毒性试验，所得结果就有很大参考性。二是选择目前常见的混养品种，某种鱼和某种虾在同一试验环境下开展试验。目前，有关亚硝酸盐对单胞藻、大型藻类、海胆和海参等的试验还较少。单胞藻作为重要的海洋初级生产力，是水产动物的天然饵料，但随着市场经济的日益发达，工、农废物以及人类生活废弃物对海洋的污染，导致了沿海地区赤潮频繁、内陆海洋水华不断，亚硝酸盐作为单胞藻的氮来源，是引起这些问题的主要因素之一，有待进一步深入研究。三是养殖技术方面，生物絮凝技术（BFT）是一种将环境污染降到最低的创新方法，因为它不涉及水的交换。BFT能使水中的有益微生物将氨氮和亚硝酸盐转化为硝酸盐。生物絮凝体中的微生物有助于水产养殖鱼类的免疫功能和生理活性的提高，促进生长。开发利用BFT养殖鲆鲽类，可以提高其育种水平，所以需要对生物絮团养殖环境中各种物质的耐受性标准进行更多的研究。

水产养殖业在中国以及全球都是主要的食物供应行业之一，做好水产养殖的研究工作有利于推动其科学、健康、长期稳定的增长，对保证全国食品供应、推动社会主义市场经济建设、改善从业者收入水平以及提高人们生活质量等具有很大意义。