植物多酚-牛血清白蛋白相互作用及对蛋白质结构的影响

刘丽莉，于 影，苏克楠，张潇丹，程伟伟，贺家亮

（河南科技大学食品与生物工程学院，食品加工与安全国家级教学示范中心，食品加工与质量安全控制河南省国际联合实验室，洛阳 471023）

0 引言

牛血清白蛋白（bovine serum albumin,BSA）是牛血清中含量最多的蛋白质，氨基酸种类丰富、组成平衡。BSA 是一种球状可溶性蛋白，已广泛应用于生化工程，由于环境条件变化、食品加工处理，其结构和功能特性会受到影响[1]。

植物资源中获得的酚类化合物可以作为金属离子螯合剂、氢供体、单线态氧猝灭剂或还原剂，通常可作为添加物改善食品的品质[2]。植物多酚独特的化学结构使其具有抗氧化[3]、抑菌[4]、抑制酶活性[5]等功能。多酚类化合物中丰富的酚羟基可通过静电、氢键、疏水相互作用等非共价键结合蛋白质[6]。多酚-蛋白质相互作用影响蛋白质和多酚的结构、稳定性和功能特性形成复合物[7]，这些作用可以使蛋白质在处理和储存时更加稳定，从而提高蛋白质的品质和保质期。

国内外近年进行的有关多酚与蛋白质相互作用的研究，主要集中在蛋白结构、互作机制、功能特性[8]等方面，如MENG 等[9]发现绿原酸和乳清蛋白分离物非共价结合导致蛋白的二级结构改变，ɑ-螺旋和β-折叠向β-转角和无规卷曲转变；王振国等[10]研究大豆分离蛋白与葡萄籽原花青素的相互作用，复合物的溶解度、乳化活性指数、乳化稳定性指数、ζ-电位绝对值及持水性均显著提高。对多酚与BSA 相互作用的研究涉及多种多酚类化合物，主要包括类黄酮、花青素等，如LIANG 等[11]研究了BSA 与三卤苯酚的相互作用。MIHAELA 等[12]采用荧光猝灭法和分子对接探讨了pH 值为7.5 和298 K 条件下BSA 与不同多酚的相互作用，发现不同种类多酚如表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）、黄酮（flavonoids）和羟基肉桂酸（p-hydroxy cinnamic acid）等对蛋白影响不同，其中EGCG 影响较大。LIU等[13]研究了乳清分离蛋白（whey protein isolation，WPI）分别与4 种多酚EGCG、槲皮素（quercetin，QC）、芹菜素（apigenin，AG）、柚皮素（naringenin，NG）的相互作用，WPI-EGCG 结构变化最明显且具有最好的抗氧化性能和热稳定性。ANITHA 等[14]通过紫外-可见吸收和荧光光谱研究了儿茶素和表儿茶素与牛血清白蛋白的相互作用，发现两种多酚在单个结合位点都表现出与BSA 的强烈相互作用，多酚-BSA 复合物具有更致密的结构。YU 等[15]发现茶黄素-3，3'-二甲酸酯（theaflavin 3,3′-digallate，TFDG）与BSA 相互作用属于静态淬灭，互作后BSA 周围的微环境疏水性更强，α-螺旋增加，结构紧密，疏水相互作用和氢键主导TFDG 与BSA 之间的相互作用。ZHANG 等[16]研究了谷蛋白（glutenin，Glu）/麦醇溶蛋白（GLIADIN，Gli）与绿原酸（chlorogenic acid，CA）/木犀草素（luteolin，LU）的相互作用机制，及其对Glu/Gli 结构和CA/LU 抗氧化活性的影响，发现CA/LU 的相互作用机制和对Glu/Gli 结构的影响存在显著差异。综上所述，不同的多酚和蛋白质相互作用对蛋白质的结构和功能影响不同，并且不同的植物多酚与BSA 之间的相互作用及对BSA 结构的影响尚不清楚。

因此，本研究选择4 种不同的植物多酚：原花青素（proanthocyanidins，PC）是儿茶素或表儿茶素的聚合体，是目前国际公认的清除机体自由基最有效的天然抗氧化剂[17]，其性质受产地的影响；儿茶素（catechin，C）是茶多酚抑菌的主要有效成分，属于黄烷醇类物质[18]；表没食子儿茶素没食子酸酯（Epigallocatechin gallate，EGCG）是绿茶表儿茶素类含量最高的一个单体成分，占儿茶素的50%～70%，具有有效成分明确、活性更强等优点[19]；茶多酚（tea polyphenol，TP）是茶叶中多酚类物质的总称，被证实是一种有效的抗菌物质[20]。通过紫外光谱、荧光光谱、红外光谱、分子对接等多种方法研究PC、C、EGCG、TP 与BSA 的相互作用及蛋白质结构的变化，探究不同多酚对BSA 相互作用和对BSA 结构的影响，筛选出最稳定的植物多酚-BSA 复合物，以期为植物多酚和BSA 的高值化利用、产品开发提供理论依据，扩展植物多酚与蛋白质的应用前景。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

牛血清白蛋白（BSA，纯度＞97%）购自上海谱振生物科技有限公司；原花青素（PC，纯度＞98%）产地为河南省郑州市，来源于葡萄籽提取物；儿茶素（C，纯度＞97%）由产自安徽的茶叶中提取；表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG，纯度＞95%）是从福建绿茶中分离得到的儿茶素类单体；茶多酚（TP，纯度＞98%）福建绿茶多酚提取物；多酚购自天津德恩试剂有限公司；0.05 mol/L pH 6.8 的Tris-HCl 溶液为河南科技大学食品学院实验室配制。其他试剂均为分析纯级。

1.2 主要仪器与设备

电子分析天平(BBA124S)，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；紫外分光光度计(752N)，北京宏达恒业科技有限公司；低速中等容量离心机（TD5Z），金坛区金城春兰实验仪器厂；旋涡混合仪（XH-B），无锡杰瑞安仪器有限公司；紫外可见分光光度计石英比色皿，宜兴市谱析光学元件厂；荧光分光光度计(Cary eclipse 型），美国Aglient 公司；傅里叶变换红外光谱仪（Spectrum 10 型），上海铂金埃尔默仪器有限公司；扫描电子显微镜（JSM-7500F 型），富瑞博国际有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 紫外可见光谱测定多酚-BSA 相互作用

参考ZANG 等[21]的方法并改进，用Tris-Hcl 缓冲液和BSA 粉末配制浓度为1.0×10-5mol/L BSA 溶液。将BSA 溶液和等量不同浓 度1×10-5、5×10-5、1.0×10-4、1.5×10-4、2.0×10-4mol/L 的PC、C、EGCG、TP，充分混匀，在290 K 分别反应30 min。以不加多酚的BSA 和不加BSA 的多酚为对照组，将待测样品倒入1 cm 比色皿中。扫描波长：200～450 nm。

1.3.2 荧光光谱测定多酚-BSA 相互作用

按照上文的方法制备2 组样品溶液，上述样品分别在290 和300 K 条件下反应。根据熊喆等[22]的方法改进，测定条件为：激发波长（280 nm），激发和发射狭缝（10 nm），扫描范围（300～450 nm）。

为了更好地解释4 种多酚与BSA 结合的猝灭类型，采用Stern-Volmer 方程计算[23]：

式中Kq、Ksv、τ0和Cq分别代表荧光猝灭速率常数（L/mol）、动态猝灭常数（L/ mol）、不存在猝灭剂时荧光物质的平均寿命和多酚的浓度（mol/L），F0为不加多酚时BSA 的荧光强度，F为加入多酚后的荧光强度。

多酚与蛋白质相互作用过程中结合常数和结合位点数可以通过式（2）计算[24]。

其中Q为多酚的浓度，mol/L；KA为结合常数；n为结合位点数。

1.3.3 傅里叶红外光谱测定多酚-BSA 相互作用

根据江连洲等[25]的方法并适当改进，将1.0×10-5mol/L 的BSA 溶液和2.0×10-4mol/L 多酚溶液各2 mL混合后用Tris-Hcl 缓冲液定容至10 mL，在290 K 温度下，避光磁力搅拌，反应30 min。进行冷冻干燥后，将1 mg 的BSA 和多酚-BSA 样品分别与99 mg 溴化钾混合磨粉并压制成片。利用傅里叶变换红外光谱仪进行全波段扫描，设置扫描次数为32，测量波数4 000～500 cm-1，分辦率4 cm-1。

1.3.4 分子对接模拟

参考王晓霞等[26]的方法，从PBD 数据库下载BSA分子构象，采用DFT 算法进行能量优化，使用Gaussian 09W 软件对BSA 进行能量最优化处理。利用PubChem数据库查找多酚的分子构像。打开AutoDockTools-1.5.6，分别读取大小分子，进行相应的去水、加氢和加电荷。正式对接（Docking）采用遗传算法(genetic algorithm，GA)，对接次数为100 次，通过AutoDock Vina 对接后的结果，筛选出最优簇中结合能最低的构象并记录对接后的结合能。确定4 种多酚与BSA 结合最佳的构象，用PyMOLWin 打开进行氢键标出和构象的修饰，最后保存修饰结果。

1.4 数据处理与分析

试验测定结果均做3 次重复，试验数据利用Origin 2021 软件绘图，用DPS 软件进行显著性分析（P＜0.05）。使用AutoDockTools-1.5.6 软件进行分子对接。

2 结果与分析

2.1 紫外可见光谱分析植物多酚-BSA 相互作用及BSA结构变化

如图1 所示，与多酚和BSA 对照组的紫外图谱比较，多酚-BSA 紫外吸收峰的位置和强度均发生了变化，说明二者相互作用产生了新的复合物。随着PC、C、EGCG、TP 添加量的增加，BSA 在286 nm 的最大吸收峰都呈现上升的趋势且发生红移。可能由于多酚和蛋白质大分子的碱基对π 电子结合，多酚的π＊空轨道与碱基对的π 轨道偶合，使能量降低，导致π→π＊跃迁能量降低。红移波长由大到小为EGCG（292 nm）、PC（288 nm）、C（288 nm）、TP（288 nm），说明EGCG 与BSA 的相互作用对蛋白质结构影响最大。这可能由于EGCG 是单体多酚，较易进入蛋白质分子的疏水氨基酸残基中并通过疏水相互作用结合形成疏水腔，从而导致EGCG-BSA吸收峰的红移最明显。任红涛等[6]发现花生致敏蛋白与咖啡酸相互作用后紫外吸收蓝移，与本研究结果相反，这是由于咖啡酸的助色团或发色团使得花生致敏蛋白多肽链伸展而发生蓝移。

图1 PC、C、EGCG、TP 与BSA 结合的紫外-可见吸收光谱图Fig.1 UV-Vis absorption spectra of PC,C,EGCG,TP combined with BSA

2.2 荧光光谱分析植物多酚-BSA 相互作用及BSA 结构变化

荧光光谱可用来表征蛋白质的三级结构变化，当荧光光谱最大发射波长发生红移或者蓝移，说明氨基酸残基周围微环境改变，极性增强[27]。PC、C、EGCG、TP与BSA 结合的荧光光谱图如图2 所示，随着4 种多酚浓度增加，BSA 荧光强度逐渐下降，说明多酚与BSA 均发生了相互作用，使得更多的酪氨酸或色氨酸荧光猝灭，最终导致荧光强度降低。荧光强度的降低，表明两个分子形成了复合物[28]。4 种多酚最大波长红移由大到小为EGCG、PC、C、TP（365 nm、364 nm、364 nm、363 nm），说明EGCG使BSA 的微环境变化最大，可能由于EGCG 的结构中含有邻苯二酚结构，邻苯二酚结构具有较强的氢键相互作用力和较强的亲水性，能与BSA相互作用形成疏水性较低的复合物，从而导致EGCG 与蛋白质结合后荧光光谱出现明显的红移现象。这与紫外可见光吸收光谱的研究结果一致。ZHANG 等[29]研究槲皮素与大豆分离蛋白相互作用，与本试验结果不相符，可能是形成的槲皮素-大豆分离蛋白复合物疏水性较强，造成荧光最大波长蓝移。

图2 PC、C、EGCG、TP 与BSA 结合的荧光光谱图Fig.2 Fluorescence spectra of four polyphenols PC、C、EGCG、TP combined with BSA

2.2.1 猝灭类型的确定

图3 展示了以F0/F为y轴，对Cq（0～2.0×10-4mol/L）做线性回归方程的结果。由于不存在猝灭剂时荧光物质的平均寿命为10-8s，可以通过回归方程的斜率求出Kq、Ksv，见表1。通过表1 可知，反应温度升高时Ksv值呈现下降的趋势，说明4 种多酚对BSA 的猝灭机制可能是静态猝灭。与CEYLAN 等[30]对脱酚榛子粉蛋白分离物和榛子皮酚类提取物的研究结果类似。在290、300 K 温度下[31]，多酚对蛋白质的猝灭速率常数数量级为1013，超过了动态猝灭常数的最大值，证明4 种多酚对BSA 的猝灭类型均是静态猝灭。温度升高时，复合物的Ksv减小。其中EGCG-BSA 的Ksv减小最明显，说明EGCG-BSA 受温度影响较大，EGCG 分子中的邻苯二酚结构在高温下可能会发生断裂或变形，从而导致其与BSA 结合的相互作用力发生减弱，导致荧光猝灭常数减小明显。

表1 不同温度下PC、C、EGCG、TP 与BSA 相互作用的动态猝灭常数、荧光猝灭速率常数Table 1 Stern-Volmer quenching constants and bimolecular quenching rate constants for the interaction of PC、C、EGCG、TP with BSA at various temperatures

图3 PC、C、EGCG、TP 与BSA 相互作用的Stern-Volmer 图Fig.3 Stern-Volmer diagram of PC、C、EGCG、TP interacting with BSA

2.2.2 结合常数和结合位点的确定

根据式（2），对lg(F0-F)/F和lgQ作双对数图，如图4 所示。通过线性回归方程拟合，得到多酚与BSA 的结合常数和结合位点数，其结果见表2。由表2 可知，结合常数KA与猝灭常数Ksv随温度变化的规律相同，温度越高，结合常数KA越小，均为103级，证明4 种多酚与BSA 存在较弱的相互作用力。这与文献中对几种多酚配体和BSA 结合的研究结果类似[7]。4 个相互作用体系的结合位点数n都接近于1，说明4 种多酚与BSA 分别在一个位点发生结合。刘玉茜等[32]研究表儿茶素分子与铁蛋白的结合位点数n=98.5，与本试验结果不符合，原因可能是不同蛋白质和多酚的结构不同导致结合位点数存在差异。

表2 不同温度下（290 K、300 K）PC、C、EGCG、TP 与BSA 相互作用的结合常数和结合位点数Table 2 Binding constants and number of binding sites for interaction between PC、C、EGCG、TP and BSA at different temperatures (290 K,300 K)

图4 不同温度下四种多酚与BSA 相互作用lg(F0-F)/F 对lgQ的关系曲线图Fig.4 Relationship between lg(F0-F)/F and lgQ between four polyphenols and BSA at different temperatures

2.3 红外光谱分析植物多酚-BSA 相互作用及BSA 结构变化

酰胺I 带(1 600～1 700 cm-1）对蛋白质的二级结构的改变比酰胺II 带更为敏感[33]，因此常被用来解析蛋白质的二级结构。如图5 所示，BSA 与4 种多酚结合后，酰胺Ⅰ带吸收峰（1 657.44 cm-1）发生蓝移，说明氢键参与了相互作用。蓝移程度由大到小为PC（1 656.15 cm-1）、TP（1 632.07 cm-1）、EGCG（1 631.49 cm-1）、C（1 631.44 cm-1），说明PC 与BSA 结合产生的氢键最多。可能由于PC 分子中含有更多的羟基官能团，因此在BSA 分子中更容易形成氢键相互作用，影响BSA 的二级结构，从而导致酰胺I 带发生更大程度的蓝移。这与王然等[34]通过红外光谱发现茶多酚-淀粉酯纳米颗粒之间存在氢键和疏水相互作用的研究结果类似。

图5 PC、C、EGCG、TP 与BSA 复合物的的傅里叶变换红外光谱图Fig.5 Fourier transform infrared spectra of PC、C、EGCG、TP with BSA complexes

表3 为BSA 及多酚-BSA 复合物的酰胺I 带二级结构组成比例。与BSA 比较，复合物二级结构中各组成的含量发生了显著变化。添加TP、PC、C 之后，BSA 二级结构由β-转角、无规卷曲转变为β-折叠、ɑ-螺旋，β-折叠、ɑ-螺旋相对含量的增加，表明TP、PC、C 增强BSA 构象的致密性。DAI[35]等发现儿茶素与大豆蛋白相互作用后，蛋白质的二级结构变得松散无序，与本研究结果不同，可能是与儿茶素的相互作用导致蛋白质内部结构被打开，形成不稳定的蛋白结构。氢键是维持α-螺旋结构的主体力量，α-螺旋的增加说明多酚-BSA 疏水区域内有新的氢键形成。β-折叠含量呈现增加的趋势，这与蛋白质疏水性区域变紧密后蛋白质位点减少有关，其中C-BSA（40.20%）、PC-BSA（39.50%）、EGCG-BSA（39.32%）、TP-BSA（34.04%），证明C 更能促进BSA 的二级结构稳定，可能由于C 丰富的羟基（-OH）可与蛋白质中的带氧或氮原子的基团形成氢键，氢键可以增强蛋白质分子间的相互作用，使其结构变得更加紧密[36-37]。

表3 PC、C、EGCG、TP 与BSA 互作后酰胺Ⅰ带二级结构组成比例Table 3 Proportion of secondary structure of amide I band after PC、C、EGCG、TP interact with BSA

2.4 分子对接

分子对接可以弥补光谱法的不足，更直观、充分地认识小分子与大分子间的结合特性[38]。图6 为多酚PC、C、EGCG、TP 与BSA 的分子对接图。

图6 PC、C、EGCG、TP 与BSA 分子对接图Fig.6 Molecular docking diagram of PC,C,EGCG,TP and BSA

分子对接结果显示，4 种多酚与BSA 的相互作用位点位于蛋白质分子的Sub-domain IIA 疏水腔中。ZHANG等[39]利用藜芦醇和姜黄素与β-乳球蛋白进行分子对接，结合方式和位点与本试验不相符，参与相互作用的原子和空间结构互补的位置不同，导致对接结果不同。PC与BSA 的Gln-416、Lys-533、Ala-500 残基相邻，之间距离分别为2.6 Å、2.5 Å和2.6 Å，分子间主要存在氢键相互作用力。C 与BSA 的Thr-305、Pro-303、Arg-336等残基相邻，并存在氢键相互作用力，又与Leu-301 疏水性残基相邻，表明它们之间存在疏水相互作用力，距离分别为2.6 Å、3.4 Å、2.0 Å以及2.1 Å。C 与BSA 形成疏水作用力为主、氢键相互作用为辅的结合模式，形成较为稳定的构象。EGCG 和BSA 的Lys-116、Tyr-160、Glu-125 等残基相邻，之间距离分别为2.1 Å、2.2 Å以及2.5 Å，BSA 的Tyr-160 残基与EGCG 之间存在π-π 相互作用，这一发现解释了EGCG 会导致BSA 荧光的猝灭。一般情况下，键长越接近2.5 Å则氢键作用力越强。氨基酸Glu-125 与EGCG 间的键长较接近2.5 Å，即Glu-125与EGCG 结合时产生了较强的氢键作用。TP 和BSA 的Glu-564、Ala-510 残基相邻，距离分别为3.2 Å、2.3 Å，存在氢键作用及疏水相互作用。与ZANG 等[40]对蓝莓花青素（ANs）和乳清分离蛋白（WPI）通过氢键和疏水力相互作用的研究结果一致。4 种多酚的结合能C、EGCG、PC、TP（-3.72 kJ/mol、-1.77 kJ/mol＜-1.02 kJ/mol、-0.38 kJ/mol），C-BSA 表现出最好的结合能力，可能是由于C 的苯环具有疏水性，能与蛋白质的疏水腔紧密结合，EGCG 则由于氢键对接位点多，能与BSA 稳定结合。分子对接结果进一步支撑上述光谱试验结果。

3 结论

本文通过紫外光谱法、荧光光谱法、红外光谱法和分子对接等技术探讨了4 种植物多酚与牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）的相互作用及结构的变化。结论如下：

1）随着多酚浓度增加，286 nm 处的紫外吸收峰明显增大并且发生红移表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)、原花青素（proanthocyanidins，PC）、儿茶素（catechin，C）、茶多酚（tea polyphenol，TP），多酚与BSA 相互作用产生了新的复合物，其中EGCG 与BSA 的相互作用对蛋白质结构影响最大。

2）通过荧光光谱分析，4 种多酚引起BSA 的猝灭现象是动态猝灭和静态猝灭共同作用的结果，结合位点大致相同，结合位点数n接近于1，说明多酚与蛋白质之间只存在一个结合位点。

3）多酚能促进BSA 的二级结构稳定，使BSA 酰胺Ⅰ带的吸收峰发生蓝移PC、TP、EGCG、C，其中PC与BSA 结合产生的氢键最多；酰胺II 带峰形变宽，说明有新的氢键产生；BSA 二级结构由β-转角、无规卷曲转变为β-折叠、ɑ-螺旋，β-折叠含量呈现增加的趋势CBSA、PC-BSA、EGCG-BSA、TP-BSA，表明C 更能促进BSA 的二级结构稳定。

4）分子对接进行验证发现，结合位点位于Subdomain IIA 的疏水腔中，分子间相互作用力主要是氢键、疏水作用力，结合能C 和EGCG 最小，形成的复合物最稳定。

研究结果表明，4 种植物多酚能与BSA 相互作用，多酚的加入使得BSA 的结构更加紧密和稳定，其中C、EGCG 与BSA 相互作用的程度最大、结构最稳定。该研究可为植物多酚与BSA 相互作用机理分析及开发多组分共存的复合物提供参考。