在线固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法检测水中15种三嗪类农药

张恒 陈苗 孙善伟 孙晓雷 侯嵩 郭昌胜徐建 孙文军

1（中国环境科学研究院环境健康风险评估与研究中心， 北京 100012）

2（国家环境保护化学品生态效应与风险评估重点实验室， 北京 100012）

3（新疆阿克苏地区环境保护监测站， 阿克苏 843000）

4（沃特世科技（上海）有限公司， 上海 201206）

三嗪类农药（Triazine pesticides，TPs）是一类高效选择性除草剂，具有化学性质稳定、适用范围广等特点[1-2]。TPs 分子具有低水溶性，易吸附到土壤中，并随着降水、径流和沉降等方式进入环境，长期存在于环境介质中[3]。中国、希腊和法国等多个国家[4-6]的地表水和海洋中频繁检出三嗪类除草剂。我国长江、黄河、太湖和松花江等重点流域地表水中阿特拉津（一种三嗪类农药）检出率为100%，平均浓度范围在7.0～1289.5 ng/L 之间，浓度差异较大[7-8]；其它三嗪类农药（如扑草净、扑灭津和莠灭净）在莱州湾海域也均有检出（未检出～29.4 ng/L）[9]，其中，扑草净在黄渤海沿岸海域中最高浓度达627.5 μg/L[6]。TPs 具有一定的致癌性和免疫毒性[10-11]，如阿特拉津可使雄性青蛙雌性化[12]；水中的莠灭净可能导致肾脏充血、低血压等疾病[10，13-14]；TPs 可以结合受体激素，干扰中枢神经和大脑发育[15]。多个国家将阿特拉津、西玛津和嗪草酮等TPs 列入内分泌干扰剂化合物名单[16]，如美国环保署规定饮用水中阿特拉津和西玛津含量分布不得超过3 和4 μg/L[17]，我国《水环境质量标准》（GB 3838—2002）[18]集中式生活饮用水特定项目标准限值中也规定了三嗪类除草剂阿特拉津的浓度不得超过3 g/L。我国地表水环境中TPs 残留情况比较普遍，同时具有浓度差异大的特点，因此，开发高灵敏度、多种TPs 同时快速测定的方法十分必要。

目前，水体中农药常用的检测方法包括气相色谱法（GC）、气相色谱-质谱联用法（GC-MS）[19]、高效液相色谱法（HPLC）[20]和液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）[21]等。Djozan 等[19-20]使用GC-MS 测定水中阿特拉津、西玛津、扑灭津和扑草净，检出限在20～80 μg/L 之间，HPLC 测定大豆中西玛津、阿特拉津、莠灭净、扑灭津和特丁津5 种TPs 的检出限在0.668～1.16 μg/L 之间。与GC-MS/MS 相比，使用HPCC-MS/MS 对水样预处理的要求更低，并且该方法具有更低的检出限、更宽的适用范围和更好的分析性能[22-23]。李少飞等[24]使用HPLC-MS/MS 测定地表水和地下水中的阿拉特津，检出限低至20 ng/L。

水体中TPs 的污染物整体赋存水平较低，直接进样法虽然便捷快速，但难以满足部分农药类物质的灵敏度需求，需富集后测定。常用的富集前处理方法包括固相萃取（Solid phase extraction，SPE）[25]、超声萃取[26]和索氏萃取[27]等。索氏萃取耗费时间长，有机溶剂使用量大，萃取过程中目标物质可能会受热分解；超声萃取和固相萃取相较于索氏萃取具有有机溶剂消耗低、萃取效率高的优点，但成本高，费时费力。在线固相萃取技术（Online-SPE）与传统的固相萃取相比，上样时间由1～2 h 缩短到几分钟，水样体积由几百毫升降低至几毫升，样品采集、运输及保存的便捷性显著提升。同时，Online-SPE 自动化程度高，能够有效减少人工误差。目前，该技术已被用于多种基质中药物残留的检测[28-30]。安永生等[31]采用Online-SPE-HPLC-MS 测定水中阿特拉津，进样量为2.5 mL 时，检出限为8 ng/L，实际水样加标回收率为91.6%～101.0%。陈永艳等[32]使用Online-SPE-HPLC-MS/MS 测定水源水和饮用水中典型农药及代谢产物，方法检出限为0.03～1.5 ng/L， 但107 种农药中仅含5 种TPs。

本研究结合Online SPE 方便快捷和LC-MS/MS 灵敏度高、分析速率快的优势，从SPE 柱选择、质谱条件和液相色谱条件3 个方面对方法进行优化，建立了在线固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱（Online SPE-UPLC-MS/MS）同时测定水中15 种TPs 的方法。应用本方法对北京温榆河地表水3 个点位的15 种TPs 进行测定，以考察TPs 在北京市地表水河流中的残留水平。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

2777C-FLR 在线固相萃取-ACQUITYQSM-BSM 超高效液相色谱仪-Xevo T-QS 三重四极杆串联质谱（美国沃特世公司）；Oasis HLB Direct Connect 在线固相萃取柱（20 mm × 2.1 mm， 5 μm， 美国沃特世公司）；ACQUITYUPLC®BEH C18反相色谱柱（50 mm × 2.1 mm， 1.7 μm， 美国沃特世公司）；Milli-Q 超纯水仪（美国Millipore 公司）。0.22 μm 聚醚砜水相针式滤头（美国沃特世公司）。

乙腈、甲醇和甲酸（色谱纯，美国Fisher Scientific 公司）。15 种TPs 标准品购自美国Sigma-Aldrich公司，详细信息见表1。标准品用甲醇溶解，配制成1000 mg/L 的单标标准储备液，于-20 ℃保存备用；将上述15 种TPs 单标用超纯水稀释，配制成各TPs 浓度均为10 mg/L 的混合标准溶液。

表1 15种三嗪类农药（TPs）的物理化学性质Table 1 Physical and chemical properties of triazine pesticides (TPs)

1.2 样品采集及前处理

采集北京市温榆河地表水水样，置于洗净的棕色试剂瓶中，于4 ℃保存。水样加入适量的内标标准液（Atrazine-d5，100 μg/L）， 经0.22 μm 针式滤头过滤后，待测。

1.3 Online SPE-UPLC-MS/MS分析参数

Online SPE 条件 使用Online SPE 模式进样，进样体积为1000 μL， 全自动Online SPE 装置配有两根Online SPE 柱，交替使用。在0～3.8 min 时，四元泵完成样品从自动进样器到Online SPE 柱的富集；4.1 min 时，六通阀切换至分析流路中；4.1～11.0 min 二元泵将富集在Online 萃取柱进行冲洗和活化，Online SPE 装置流路示意图见图1。

UPLC 测定条件 柱温箱温度40 ℃；流动相：四元泵用于富集样品，四元泵流动相A 为纯水，B 为乙腈，C 为甲醇。四元泵梯度洗脱程序：0～0.5 min，100% A；0.5～3.8 min，100% A；3.8～4.1 min，100%C；4.1～8.0 min，100% C；8.0～8.1 min，50% A，50% B；8.1～12.0 min，100% A。二元泵用于色谱分析，二元泵流动相A 为乙腈，流动相B 为0.5%甲酸（含10 mmol/L 的醋酸铵）。二元泵洗脱程序：0.0～3.8 min，20% A；3.8～4.1 min，20% A；4.1～5.0 min，20%～50% A；5.0～10.0 min，55% A；10.0～10.1 min，50%～98% A；10.1～12.0 min，98% A；12.0～12.1 min，98%～20% A；12.1～13.0 min，20% A。

MS/MS 检测条件 毛细管电压设定为2.15 kV， 离子源温度为150 ℃，去溶剂化温度为400 ℃，脱溶剂气流量为1000 L/h。采用正离子多反应监测模式（MRM）记录色谱图。使用氮气作为去溶剂化和雾化气体，碰撞气为氩气。

2 结果与讨论

2.1 检测方法的优化

2.1.1 质谱条件的优化

配制浓度为100 μg/L 的15 种TPs 的单一标准溶液，采用电喷雾正离子模式（ESI+），以准分子离子为母离子，分别对15 种单标溶液进行二级质谱扫描，利用沃特世公司软件的自动调谐功能对子离子质荷比、锥孔电压和毛细管电压等参数进行自动优化，选择丰度较高的两个碎片离子作为定量离子和定性离子。优化后的质谱参数见表2。

表2 15种TPs的质谱分析条件Table 2 Mass spectrometry conditions for 15 kinds of TPs

2.1.2 液相色谱分析条件优化

十八烷基硅烷键合硅胶（C18）类色谱柱是目前最常用的液相色谱分离柱，刘彬等[33]比较了TPs 在ZORBAX Eclipse Plus C18柱和SB-C18柱（后者具有二异丁基侧链基团，耐酸性更强）上的分离情况，发现ZORBAX Eclipse Plus C18柱无法分离西草净、阿特拉津、扑灭津和莠灭净，SB-C18柱无法分离阿特拉津和去草净，但两种色谱柱都可实现定量分析，其中，SB-C18柱分离时间略长于ZORBAX Eclipse Plus C18。吴春英等[34]利用ACQUITYUPLC®BEH C18反相色谱柱实现了27 种TPs 的完全分离，并且分离的峰形尖锐对称。因此，本研究选用ACQUITYUPLC®BEH C18反相色谱柱，以获得较好的色谱保留和色谱峰形。

使用15 种TPs 混合标准溶液，在Open Architecture（OA）模式下，对比了乙腈-0.1%（体积分数，下同）甲酸、甲醇-0.1%甲酸、乙腈-0.5%甲酸、甲醇-0.5%甲酸、乙腈-0.5%甲酸（含10 mmol/L 醋酸铵）和甲醇-0.5%甲酸（含10 mmol/L 醋酸铵）6 种流动相条件下15 种TPs 的信号强度，结果表明，流动相为乙腈-0.5%甲酸（含10 mmol/L 醋酸铵）时，15 种TPs 的信号强度最好。

2.1.3 Online SPE条件优化

SPE 柱的填料种类对目标化合物的富集有决定性影响。目前，TPs 进行大体积离线富集时多采用HLB[34-35]和C18[36]SPE 柱，因此，本研究选用XBridge C18和Oasis HLB 这两种通用型SPE 柱进行对比。优化液相色谱梯度洗脱条件后，使用这两种SPE 柱对目标分析物进行富集，结果表明，使用Oasis HLB 柱时，极性较强的目标化合物（如扑灭通和扑灭津）的色谱响应值更高。因此，本研究选用Oasis HLBSPE 柱进行在线富集。

利用15 种TPs 的混合标准溶液，洗脱溶剂为纯甲醇，对比了纯水和不同浓度甲酸溶液作为上样溶剂时，各目标化合物的响应强度。如图2 所示，纯水作为上样溶剂时，除西草净外，其它14 种TPs 的富集效果较好；0.5%甲酸作为上样溶剂时，西草净的富集效果最好，而其它14 种TPs 的富集效果略差。综合考虑，本研究选取纯水作为上样溶剂。

图2 15 种TPs 在不同上样和洗脱体系中的响应：（A）上样溶剂为超纯水，洗脱溶剂为乙腈；（B）上样溶剂为超纯水，洗脱溶剂为甲醇；（C）上样溶剂为0.1%甲酸，洗脱溶剂为甲醇；（D）上样溶剂为0.5%甲酸，洗脱溶剂为甲醇。Fig.2 Responses of 15 kinds of TPs in different loading and elution systems:(A)Sample loading with ultra-pure water and eluted with acetonitrile; (B) Sample loading with ultra-pure water and eluted with methanol;(C)Sample loading with 0.1%formic acid water and eluted with methanol;(D)Sample loading with 0.5%formic acid water and eluted with methanol.

利用15 种TPs 的混合标准溶液，上样溶剂为纯水，对比了100%乙腈和100%甲醇作为洗脱溶剂时，各目标化合物的响应强度。如图2 所示，上样溶剂为纯水、洗脱溶剂为纯甲醇时，15 种TPs 的信号强度最好。不同上样和洗脱体系下15 种TPs 的响应结果见图2，15 种TPs 的色谱图见图3（序号对应的化合物同表1）。

图3 15 种TPs 的色谱图，上样浓度为1 ng/L，上样溶剂为超纯水，洗脱溶剂为甲醇，流动相为乙腈-0.5%甲酸（含10 mmol/L 醋酸铵）Fig.3 Chromatograms of 15 kinds of TPs at concentration level of 1 ng/L. Sample is loaded with ultra-pure water and eluted with methanol. Mobile phase is acetonitrile-0.5% formic acid water (containing 10 mmol/L ammonium acetate)

2.2 方法的分析性能

2.2.1 线性关系和检出限

配制1～100 ng/L 系列15 种TPs 的混合标准溶液，采用优化的色谱条件进行检测，以峰面积对质量浓度做线性回归，15 种TPs 在各自浓度范围内具有良好的线性关系（R2＞0.994）。采用空白基质提取液逐级稀释标准溶液的方法，确定检出限和定量限，结果见表3。15 种TPs 的检出限（LOD，S/N=3）为0.001～0.036 ng/L， 定量限（LOQ，S/N=10）为0.003～0.108 ng/L。

表3 15种TPs的线性方程、线性相关系数、检出限及定量限Table 3 Linear equations, linear correlation coefficients, limits of detection (LODs) and limits of quantification (LOQs) of 15 kinds of TPs

2.2.2 回收率和精密度

在阴性水样（超纯水）中加入混合标准溶液，加标水平分别为10、20 和50 ng/L， 水样经过0.22 μm聚醚砜水相针式滤头过滤后测定，计算样品的加标回收率。由图4 可知，超纯水水样中15 种TPs 的加标回收率在69.7%～103.0%之间，RSD 在3.13%～9.98%之间，。

图4 15 种TPs 的加标回收率和精密度Fig.4 Spiking recoveries and precisions of 15 kinds of TPs (n=6)

2.2.3 实际样品分析

采用上述方法测定北京市温榆河3 个地点的地表水样品中15 种TPs 的残留量（WY1～WY3，采集时间为2021 年11 月6 日），以验证方法的实用性。样品采集后，加入适量内标，采用0.22 μm 聚醚砜水相针式滤头过滤后，采用建立的Online SPE-UPLC-MS/MS 进行测定，结果见图5。3 个水样中，WY1 和WY3中15 种TPs 均有检出， WY2 中仅苯嗪草酮未检出， TPs 的总检出浓度分别为64.49、71.35 和97.41 ng/L。根据《水环境质量标准》（GB 3838—2002）[18]中集中式生活饮用水特定项目标准限值规定，TPs 中阿特拉津的浓度不得超过0.003 mg/L， 本次检测的所有样品均未超标。样品中去异丙基阿特拉津、灭蝇胺和扑草净的环境浓度较高，温榆河两岸有大量农田和城市园林绿化带[37]，农业耕作[38]使用的除草剂可能是温榆河河水中TPs 的直接和主要来源。

图5 温榆河河水中TPs 浓度的分布图Fig.5 Distribution of TPs concentration in the Wenyu River water

3 结论

采用Online SPE 富集净化方法，结合UPLC-MS/MS 法实现了地表水中15 种TPs 残留的同时测定，样品经0.22 μm 针式滤头过滤后即可进样分析。本方法15 种TPs 的线性关系良好（R2＞0.994），检出限在0.001～0.036 ng/L 之间，定量限为0.036～0.108 ng/L。与常规TPs 检测方法相比，本方法具有分析通量高、检出限低、精确度高、检测时间短和分析效率高等特点，适用于地表水中痕量TPs 的快速测定。