菜粕和豆粕混合生产氨基酸水溶肥的发酵工艺优化

路书山,刘 浩,赵燕洲,屠继军,曹 慧①

(1.南京农业大学生命科学学院/ 农业农村部农业环境微生物工程重点实验室,江苏 南京 210095;2.安徽省宣城市宣州区农业农村局,安徽 宣城 242099)

中国是农业大国,在生产中通常使用化肥来提高作物产量,但化肥使用强度远远超过国际公认的标准[1-2]。长期不合理的化肥使用会导致土壤板结、养分失调、病虫害加剧和环境污染问题[3-4],进而危害人畜健康,不利于农业高质高效生产。菜粕和豆粕作为植物油加工副产品,粗蛋白和氨基酸含量丰富,通常被作为饲料或肥料的原料,但硫苷、单宁和植酸等抗营养因子的存在,使其利用率大大降低[5]。目前,已有多种提高菜籽粕或豆粕利用率的研究。王永红等[6]利用产蛋白酶菌株嗜麦芽糖寡养单胞菌(StenotrophomonasmaltrophiliaG12,FJ211222)和短小芽孢杆菌(BacilluspumilusK11,FJ211221)混合菌种固体发酵生产氨基酸肥料,发酵过程参数优化后的菜粕蛋白水解度达到13.1%,增加了游离氨基酸和小肽含量。LIU等[7]利用蛋白酶产生菌BacillusflexusNJNPD41作为菌种材料,显著提高了菜籽粕固态发酵产生的游离氨基酸和短肽量。WANG等[8]利用枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)菌株,通过固态发酵将豆粕蛋白水解成水溶性低相对分子质量产物,产物富含多肽和游离氨基酸,以此发酵产物作为肥料,在低浓度(ρ=2.5 g·L-1)条件下其对油菜生长有较强的促进作用。

通过施用肥料改善土壤肥力和提高作物品质是施肥的最主要目的[9-10]。目前,主要研究的肥料有微生物肥料、复合肥以及有机无机复混肥料等。微生物肥料能通过微生物的生命活动促进植物生长,改良土壤性状,但微生物肥料存在肥效慢、专性强和贮存期短等问题[11]。复合肥营养元素多,养分含量高,但养分比例固定,难以满足各类土壤和各种作物的需要,对施肥时间和施肥位置要求较高[12]。有机无机复混肥料含有有机物质和无机营养,肥料中有机部分的肥效和微生物作用较低,肥效主要是无机化肥的作用[13-14]。氨基酸水溶肥是一类以氨基酸为主体的水溶性肥料,对农业生产具有重大意义[15]。大量研究表明,植物能够吸收有机氮[16-17],而氨基酸作为构成蛋白质的最小分子,植物可以通过根系和叶片吸收这种有机氮肥[18]。施用氨基酸水溶肥还可以减缓土壤酸化速度[19-20],提升土壤有机质的分解和肥料的转化,进一步提升农产品产量和品质,最终改善土壤质量[21-22]。

笔者试验探究了各种发酵因素对氨基酸产出的影响,为氨基酸水溶肥的生产提供了重要的理论依据。尽管发酵生产氨基酸的应用已有很多,但针对不同应用场景该工艺仍需进行改进,以提高生产率和降低生产成本。通过Plackett-Burman试验、爬坡试验以及Box-Behnken Design试验设计[23]并优化菜粕和豆粕混合生产氨基酸水溶肥的发酵工艺,不仅可以减轻污染问题,还可以改善土壤环境,提高作物品质,提升农业废弃物附加值。这对推动氨基酸肥料的发展与应用,以及促进农业的高质、高效和可持续发展等都具有重要意义[24]。

1 材料与方法

1.1 供试菌种

植物乳杆菌:南京农业大学环境微生物实验室保藏菌株LactobacillusplantarumG71;酵母菌:安琪酵母股份有限公司生产,物料号为12004236;枯草芽孢杆菌:河北中保绿农作物科技有限公司生产,登记号为PD20150091。

1.2 酶

碱性蛋白水解酶(50 U·mg-1)和酸性蛋白水解酶(100 U·mg-1)均为上海源叶生物科技有限公司生产。

1.3 培养基

MRS培养基(g·L-1):蛋白胨10 g,酵母膏5 g,牛肉膏10 g,葡萄糖20 g,磷酸氢二钾2 g,醋酸钠5 g,柠檬酸三铵2 g,硫酸镁0.1 g,硫酸锰0.05 g,吐温-80 1 g;LB培养基(g·L-1):蛋白胨10 g,酵母膏5 g,氯化钠10 g;YPD培养基(g·L-1):蛋白胨20 g,酵母膏10 g,葡萄糖20 g。

1.4 种子液的制备

在250 mL锥形瓶中分装100 mL上述液体培养基,灭菌后将活化菌种转接到对应的液体培养基中。之后将接种过的MRS培养基(植物乳杆菌)置于37 ℃ 培养箱中,将YPD培养基(酵母菌)置于30 ℃、180 r·min-1摇床中,将LB培养基(枯草芽孢杆菌)置于37 ℃、180 r·min-1摇床中,分别培养24 h,将3个菌株在培养皿中划线培养获取单菌落,之后挑取单菌落转移至100 mL液体培养基中,恒温培养24 h制成种子液,用于菌种发酵培养。

1.5 菌种发酵培养液的制备

将上述种子液接种于相对应的100 mL液体培养基中,接种量为1%,继续按照上述培养条件培养24 h,即得到用于发酵优化使用的单菌发酵培养液。

1.6 正交试验设计

明确3种菌株的添加比例对发酵菜粕、豆粕混合物指标的影响,以游离氨基酸增加率作为评价指标。菌株设置3个添加水平,设计L9(34)正交试验,试验各因素水平设置为植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌和安琪酵母接种量分别为1%、5%和10%。

1.7 发酵步骤

取7 g菜粕、3 g豆粕和0.01 g碱性蛋白酶装入100 mL锥形瓶中,各菌种培养液接种比例为1∶1∶1,无菌水按试验设定的比例接入到发酵底物中,搅拌均匀,在25 ℃条件下恒温静置发酵,每隔一定时间进行翻料,培养期间每隔12 h用pH计测定pH,当pH<5时加入0.01 g酸性蛋白酶。接种量与料水比的计算:接种量按菌种发酵培养液体积与发酵底物的质量比计算,料水比按发酵底物质量与去离子水体积比计算。

1.8 pH调节与测定方法

将发酵培养基于摇床中在180 r·min-1、35 ℃条件下混合30 min,取出后静置30 s,然后测定其pH。试验时使用0.5 mol·L-1NaOH和0.5 mol·L-1HCl逐滴添加,然后用相同方式检测是否调节至预定值。

1.9 发酵产物的提取与测定方法

将发酵产物置于摇床中在150 r·min-1、35 ℃条件下提取30 min。提取结束后将锥形瓶内所有固液成分移入50 mL离心管中,放入离心机并调整转速为12 000 r·min-1,4 ℃条件下离心30 min。离心结束后将上清液移入1 000 mL容量瓶中,将残渣移入锥形瓶中加入30 mL蒸馏水继续提取。重复上述步骤3次,将容量瓶定容至1 000 mL。用茚三酮比色法测定游离氨基酸含量后计算每克物料所生产的游离氨基酸质量。

1.10 氨基酸水溶肥各成分的提取与测定

将发酵产物置于摇床中在150 r·min-1、35 ℃条件下提取30 min。提取结束后将锥形瓶内所有液体及残渣移入50 mL离心管中,放入离心机并调整转速为12 000 r·min-1,4 ℃条件下离心30 min。用电感耦合等离子体原子发射光谱仪和总氮分析仪测定其中的大量元素和中微量元素含量。

1.11 Plackett-Burman试验分析

采用PB(Plackett-Burman)试验,分析发酵时间(A)、起始pH(B)、料水比(C)、接种量(D)和翻料间隔(E)对发酵生产游离氨基酸的影响。上述5个影响因子分别取高和低2个水平,以发酵液中游离氨基酸含量作为因变量,采用Minitab 17软件设计12组试验。每组设置3个重复,各因素的高低水平如下:培养时间,120、216 h;起始pH,6、9;料水比,1∶3、1∶7;接种量,3%、7%;翻料间隔,12、24 h。

1.12 最陡爬坡试验分析

根据1.11节所述通过PB试验结果筛选出3个显著影响因子,参考各个显著因子的正负效应值并结合实际情况,确定最陡爬坡试验设计的方向及步长。以最陡爬坡试验结果的最大游离氨基酸含量,作为下一步Box-Behnken Design(BBD)试验分析的中心点。

1.13 BBD试验

采用Expert Design 8.1软件对3个因素进行BBD试验设计,制作其对游离氨基酸含量影响的响应面曲线。BBD试验设计的各因素设置及水平如下:发酵时间,192、216、240 h;起始pH,8、9、10;料水比,1∶6、1∶7、1∶8。

1.14 数据统计与分析

正交试验数据采用SPSS 22.0中单因素分析比较平均值,结合 Duncan、LSD和S-N-K等方法进行多重比较,以P<0.05作为差异显著性判断标准。

2 结果与分析

2.1 不同菌株接种量对氨基酸含量的影响

对以氨基酸含量作为评价指标的正交结果进行极差分析。由表1可知,3个菌株的最佳组合为植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌和酵母菌的培养液体积比为1∶1∶1。极差分析结果显示,3株菌对氨基酸含量影响的大小顺序为植物乳杆菌>枯草芽孢杆菌>酵母菌。正交试验结果包含该最佳组合,其游离氨基酸含量为36.4 g·kg-1,明显高于其他处理。主体间效应检验结果见表2。

表2 各菌株不同水平氨基酸含量方差分析

由表2可知,3株菌的不同添加比例对试验结果具有显著影响(P<0.05)。对于植物乳杆菌1%接种量水平试验组氨基酸含量显著高于5%和10%接种量水平(P<0.05);枯草芽孢杆菌1%接种量水平试验组氨基酸含量显著高于5%接种量水平(P<0.05),但与10%接种量水平之间差异不显著(P>0.05);酵母菌3个接种量水平试验组之间氨基酸含量差异不显著(P>0.05)。

2.2 PB试验各因素的主要效应分析

通过PB试验共得到12组结果,具体试验设计及结果见表3。PB试验回归系数t检验(表4)显示,培养时间(A)、pH(B)和料水比(C)的t值分别为4.60、2.60和3.58,其P值分别为0.004、0.041和0.012,P值均小于0.05。因素D(接种量)和E(翻料间隔)回归系数不为零的假设成立,且因素A、B和C对游离氨基酸产量有显著影响。

表3 PB试验设计和游离氨基酸含量

表4 PB试验回归系数

为明确各因素对于固体发酵的影响程度,制作标准化效应的Pareto图,结果见图1。由图1可知,各因素对于游离氨基酸产量均产生影响,影响程度大小依次为A>C>B>D>E,其中,A、B和C对于固体发酵有显著影响。因此,认为A、B和C是影响水溶性氨基酸含量的主要因素,后期试验选取这3个因素进行。

A为培养时间,B为pH,C为料水比,D为接种量,E为翻料间隔。虚线为显著性参考线。

2.3 最陡爬坡试验分析

通过PB试验筛选出A、B和C3个具有显著性影响的因子,但还需要通过PB试验拟合方程系数的正负值来确定最陡爬坡试验的方向和步长,从而设计爬坡试验。试验结果见表5,最大游离氨基酸含量出现在第4组,表明此时A、B和C水平接近最优点,故选取此水平(培养时间为216 h,起始pH为9.0,料水比为1∶7)作为后续BBD试验的中心点。

表5 最陡爬坡试验设计和结果

2.4 BBD试验结果分析

利用Expert Design进行BBD试验设计,共得到17组结果,具体试验设计和结果见表6。通过对数据进行多元回归拟合,得到响应值(氨基酸产量)对影响发酵反应的关键因素(A、B和C)的多元二次回归方程:R1(氨基酸产量)=2.55+0.026×A+0.017×B+7.625E-00×C+0.010×A×B+4.000E-003×A×C+4.250E-003×B×C-0.19×A2-0.078×B2-0.052×C2。模型显示差异达极显著水平(P<0.01),表明用回归方程描述各因素与因变量之间的关系时,因变量与各因素之间的关系显著,说明该模型可靠。而失拟项未达显著水平(P=0.313 9),表明该方程的拟合度和可信度都很高,可用于预测该发酵试验的最大游离氨基酸产量(表7)。

表6 BBD试验设计和结果

表7 BBD试验设计方差分析

响应面立体分析结果(图2)表明,各因素间交互作用对发酵生产游离氨基酸能力有影响,各因素水平存在游离氨基酸生产的最佳值。利用Expert Design 8.1软件模拟计算最优工艺参数可得,最大游离氨基酸的极值点编码:发酵时间,217.68 h;起始pH,9.12;料水比,1∶7.008。该模型预测的游离氨基酸产量最优结果可达76.4 g·kg-1。为了验证模型的预测氨基酸含量与实际氨基酸含量的拟合程度,采用优化后的发酵工艺参数重复试验3次,所得平均游离氨基酸产量达到(76.8±1.5) g·kg-1。实际氨基酸含量与理论值较为接近,表明模型有效。

R1为氨基酸产量;A为发酵时间;B为起始pH;C为料水比。

2.5 发酵产物水溶物主要成分分析

发酵产物中氮、磷和钾质量分数分别为0.453%、0.098 8%和0.257%,中量元素(Ca+Mg+S)和微量元素(Fe+Mn+Zn+Cu+B)质量分数分别为0.132%和0.002 43%。采用氨基酸自动分析仪检测出17种氨基酸,苯丙氨酸(Phe)质量分数最高,为0.106 8%,其后依次为精氨酸(Arg)和亮氨酸(Leu),其质量分数分别为0.085 5%和0.081 3%(表8)。

表8 发酵产物水溶物主要成分分析

3 讨论

不同发酵参数如pH、接种量、培养时间和料液比等会对菌株的生长代谢以及菜粕和豆粕分解能力造成影响。为提高菌株的生长能力和水溶性氨基酸产量,采用正交试验、PB试验和BBD试验对发酵参数进行优化,以充分发挥混合菌株的代谢能力,提高发酵产物得率。

固体发酵过程中基质含水量、pH、发酵时间、通气量和混菌组成等对发酵产物有着很大影响[25]。笔者研究中PB试验表明,发酵时间、pH及料水比可显著影响发酵结果。发酵时间是影响发酵效果的一个重要因素[26]。选择合适的发酵时间,不但能有效地提高发酵效率,还能减少因发酵过度而产生的不必要浪费。笔者研究发现,发酵时间会显著影响氨基酸含量,随着时间的增加,氨基酸含量呈先增高后降低趋势,这说明微生物发酵生产氨基酸并非是时间越长越好,这与多数研究结果[5]一致。这可能是由于时间延长,发酵基质内大量微生物会优先利用被分解的小分子蛋白合成自身微生物菌体蛋白。pH的变化可引起细胞膜电荷发生变化致使膜的通透性改变,从而影响微生物对于营养物质的吸收能力,以及改变营养物质的可给性,影响代谢过程中酶的活性[27]。料水比是影响微生物活性的重要因素,水分过高会导致基质黏性增加并减少基质内气体交换,但能促进基质内营养成分和菌体的流动性[28];而基质水分过低会影响乳酸菌活性,菌体生长受到抑制,酶的产量减少[29]。笔者试验中最佳料水比为1∶7.008,这一研究结果虽比多数研究者的报道高,但在氨基酸的最终产量上,游离氨基酸含量达到76.8 g·kg-1,高于多数研究结果[5]。笔者研究还发现,接种量对氨基酸含量和其他指标的影响不显著,这可能是因为随着时间的延长,各接种量最终都会达到一个基质容量内的最大微生物量[30]。

不同菌株配比对发酵生产氨基酸的效果有明显影响。王永红等[6]等使用两株产蛋白酶菌株嗜麦芽糖寡养单胞菌和短小芽孢杆菌,以菜粕为原料进行固体发酵生产氨基酸肥料,最终获得53.99 g·kg-1的游离氨基酸含量,但未进行两株菌混菌比例的优化。另外,多数研究者使用的混菌均为细菌,而笔者试验使用的混菌包含真菌和细菌,真菌在发酵过程中菌丝直接刺入固体基质,这对原材料的利用有着更为积极的作用[31]。

不同的优化步骤也会对最终优化结果产生影响。与李燕等[32]的研究结果相比,在菌株优化上笔者试验采用真菌与细菌的混菌,并对菌株进行了优化选择;在发酵的各因素水平优化上,多数研究仅开展了单因素及正交试验,未提前对影响因素进行显著性筛选。虽然最终优化结果的发酵时间较短,能加速生产,但存在对不显著因素进行优化的可能,这对提升最终产量起到消极作用;在氨基酸的最终产量上,李燕等[32]将菜粕脱毒后得到的氨基酸含量低于笔者试验结果,但对菜粕进一步水解后,氨基酸含量大大提升。可见,通过对氨基酸发酵进行优化后,采用理化方法可进一步提升发酵产物中氨基酸含量。

通过优化试验,笔者发现微生物发酵处理后终产物水溶肥中微量、中量元素及氨基酸含量较为丰富,植物体内微量元素多为酶的组成成分,而中量元素具有参与调节植物代谢、合成叶绿素和作为酶的活化剂等功能[33-34]。氨基酸具有促进作物新陈代谢、提高光合作用速率、迅速补充作物多种营养元素、调控作物营养生长等多种功效。氨基酸除了可以被植物更好地吸收利用外,还可以与中、微量元素形成稳定性强的螯合物,减少元素之间的拮抗作用,增加植物对中、微量元素的吸收[35]。

4 结论

笔者试验以豆粕和菜粕为原料,采用混合发酵工艺生产氨基酸水溶肥,通过对发酵工艺进行多步优化,探究最佳发酵参数。利用PB试验筛选出具有显著性影响的发酵因素为发酵时间、起始pH和料水比,显著性由高到低依次为发酵时间、料水比和起始pH。通过BBD试验,得到显著影响因素和游离氨基酸含量之间的回归曲线,进一步通过Expert Design绘制显著影响因素交互作用对游离氨基酸含量的响应面曲线,结果显示最佳发酵组合为发酵时间217.68 h,起始pH 9.12,料水比1∶7.008,接种量3%,翻料间隔24 h。经验证,游离氨基酸产量达到76.8 g·kg-1。上述研究结果对于农业废弃物的资源化利用以及发展生态高值农业和提升土壤质量具有重要的现实意义。