两种化学发光法检测25-羟基维生素D的性能差异及结果一致性评价

常丽 冯苏 赵东兰 王超 程丽姗 宋国威 李立新

当前,全球有近十亿人普遍存在维生素D不足或者缺乏的情况,维生素D的缺乏是一个日益严重的全球性问题。维生素D是维持骨骼健康的主要元素。儿童期维生素D的严重缺乏将导致骨骼畸形,即佝偻病。轻度缺乏将导致食物钙的利用效率下降[1]。维生素D缺乏将导致肌肉乏力;对于中老年人,维生素D对肌肉功能的影响还造成跌倒风险。迄今为止,已发现维生素D可影响200多种不同基因的表达。维生素D缺乏与糖尿病、不同种类的癌症、心血管疾病、自身免疫性疾病和先天性免疫性疾病有关[2]。可见,实验室开展检测维生素D项目,对疾病的预防、诊断及治疗具有十分重要的作用。血清 25-羟基维生素 D浓度被认为是测定全面维生素D状态的最可靠指标[3]。化学发光免疫分析仪是临床常用的诊疗分析仪器,国内大型医院多引进国外进口设备,近年来我国医改政策不断调整,国产品牌仪器也逐步兴起。但不同品牌的化学发光免疫分析仪的具体性能存在差异,此研究依据性能评价要求,应用新产业M4000P及罗氏Cobas e411两种检测平台作为国产和进口化学发光分析仪的代表,检测25-羟基维生素D的以下性能指标: 精密度、 正确度、线性范围、生物参考区间,以评估 2个检测平台的检测结果能否满足临床检测需求并对检测结果的相关性进行分析。

1 材料与方法

1.1 试验材料 145例石家庄地区>60岁的老年人空腹血清,将以上样本分别在新产业M4000P和罗氏Cobas e411检测平台上进行分析。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 新产业M4000P:直接化学发光法:试剂名称:25-羟基维生素 D(25-OH Vitamin D)测定试剂盒(化学发光法),批号:1031900301,参考区间:30～100 ng/ml;质控品 level1 10319008011,level210319008012。

1.2.2 罗氏Cobas e411:电化学发光法,试剂名称:25-羟基维生素 D(25-OH Vitamin D)测定试剂盒(电化学发光法),使用试剂批号:341671,参考区间:20～32 ng/ml,质控品 level1 276842,level2 276843。

1.3 性能验证

1.3.1 精密度验证:依据中华人民共和国卫生行业标准《临床检验定量测定项目精密度与正确度性能验证》[4],按照与临床标本相同的检测方法,2个浓度的质控品,每个浓度水平同一样品重复测定3次,连续测定5 d。判断标准:以国家卫健委室间质量评价限作为允许总误差TEa,批内精密度<1/4TEa,批间精密度<1/3TEa。

1.3.2 正确度验证:依据中华人民共和国卫生行业标准WS/T492-2016《临床检验定量测定项目精密度与正确度性能验证》[4],按照与临床标本相同的检测方法,采用两个浓度的工作校准品,每个浓度重复检测2次,连续检测5 d。单个项目的偏倚=(检测值-靶值)/靶值*100%,平均偏倚=︱偏倚︱的和/5,计算平均偏倚,平均偏倚<1/2TEa(12.5%)即为该项目验证通过。

1.3.3 线性区间验证:依据CNAS-GL037《临床化学定量检验程序性能验证指南》中6.4线性区间验证[5],分别选取性能指标中线性区间新产业线性10～150 ng/ml和罗氏0～30 ng/ml内的高值血清标本H(标本1)和低值血清标本L(标本5)各1份,并按比例配制标本2(3L+1H)、标本3(2L+2H)、标本4(1L+3H)共5个浓度系列血清,每个浓度测2次,测得均值与理论值做直线回归得到Y=bX+a。b在0.95～1.05范围内,r2≥0.95(r≥0.975)可初步判断线性范围符合要求。

1.3.4 稀释倍数验证:收集接近线性区间上限的患者血清检测3次,按照稀释倍数计算稀释后的理论值,并按照说明书建议的稀释倍数用仪器自动稀释得出实测值,同样重复检测3次,计算回收率R。如80%≤R≤120%则该稀释倍数通过验证。

1.3.5 参考区间验证:依据 CLSI C28-A3c[6],选取本院健康体检中心表观健康者样本20例进行检测,验证试剂盒给定参考区间的适用性。判断标准:若20例表观健康者检测结果≤2例在参考区间之外,则该参考区间验证通过;若>2例超出参考区间之外,则需找出原因重新验证或自行建立参考区间。

1.4 2种方法检测维生素D的结果一致性评价 依据CLSI EP09-A3文件,采用直接化学发光法和电化学发光法检测145例血清样本维生素D,所得结果采用组内相关系数(intraclass correlation efficient,ICC)和Bland-Altman偏差分析法进行2组数据的一致性评价。

1.5 统计学分析 应用SPSS 21.0统计学软件对组内相关性系数进行评价,如ICC值>0.75,则认为2组数据一致性良好;采用GraphPad Prism8.0软件进行Bland-Altman偏差分析,以X±1.96s作为一致性界限。

2 结果

2.1 2种检测平台结果分析

2.1.1 精密度分析:新产业M4000P、罗氏Cobas e411。见表1。

表1 精密度评价表

2.1.2 2种检测平台正确度评价:新产业M4000P、罗氏Cobas e411两种检测平台的平均偏倚均<12.5%,正确度验证通过。见表2。

表2 正确度验证

2.1.3 线性区间验证:选取新产业M4000P低浓度10.27 ng/ml和高浓度119.55 ng/ml,罗氏Cobas e411低浓度3.05 ng/ml和高浓度67.8 ng/ml,按照0∶4、1∶3、2∶2、3∶1和4∶0的比例稀释后进行线性分析,经线性拟合方程为Y=0.99X+0.575,r2=0.9997和Y=0.9969X+0.5523,r2=0.9996。见图1。

2.1.4 稀释倍数验证:新产业M4000P维生素D线性区间为10～150 ng/ml,线性区间足够大,临床样本不涉及稀释问题,故未进行稀释倍数验证。罗氏Cobas e411维生素D线性区间0～30 ng/ml,对其推荐的稀释倍数2倍做验证,验证通过,罗氏Cobas e411维生素D临床可报告范围上限到135.54 ng/ml。见表3。

表3 电化学发光法验证维生素D稀释倍数

2.1.5 两种检测平台参考区间比较:选择20个合格的样本,将检验结果与参考区间比较,超出参考区间数据≤10%,通过验证;>10%,则分析原因后验证。新产业M4000P,罗氏Cobas e411均符合标准。见表4。

表4 参考区间验证结果

2.2 2种检测平台检测数据一致性分析

2.2.1 组内相关系数:收集的145例石家庄地区>60岁老年人空腹血清分别用直接化学发光法和电化学发光法进行维生素D检测,应用SPSS 21.0统计学软件进行数据一致性分析。组间比较差异有统计学意义(P<0.001),两种化学发光法检测的VD结果数据间具有显著相关性,一致性相关系数ICC=0.925,ICC>0.9,提示两种化学发光法检测维生素D结果一致性极好。

2.2.2 Bland-Altman偏差分析:新产业M4000P的直接化学发光法和罗氏Cobas e411电化学发光法进行维生素D检测结果在收集的检测均值偏低范围(7.65～20 ng/ml)表现出极佳的一致性,在中间偏高范围(20～60.68 ng/ml)的一致性稍有逊色。随VD浓度增大,偏差增大的可能性增大。其中有5.5%(8/145)的点在95%的一致性界限(差值的均值±1.96SD)之外,一致性上限以上的点(2个)少于在一致性下限以下的点(6个),差值绝对值最大可达12.52 ng/ml(一致性界限为-6.7～5.18)。2种方法随VD浓度越大在约>20 ng/ml,偏差增大的可能性越大。见图2。

图2 两种方法检测VD的Bland-Altman偏差分析

3 讨论

25-羟基维生素D是应在血中被检测的代谢物,由于它是人体内维生素D的主要储存形式,通过检测它可以确定总维生素D的情况[7,8]。此研究依据CNAS-GL037《临床化学定量检验程序性能验证指南》中的性能验证要求,对直接化学发光法和电化学发光法25-羟基维生素D检测的正确度、精密度、线性范围和参考区间等进行验证,验证结果表明25-羟基维生素D性能符合临床检测需求。新产业M4000P的直接化学发光法与罗氏Cobas e411的电化学发光法检测25-羟基维生素D的正确度即偏倚均满足1/2TEa要求。25-羟基维生素D直接化学发光法检测的精密度两个水平2.49%和1.63%,电化学发光法精密度为5.37%和3.64%,均满足各自说明书声明的精密度要求,但德国罗氏Cobas e411电化学发光法在精密度方面表现较国产新产业M4000P直接化学发光法略差,分析原因由于新产业M4000P为新装机,而罗氏Cobas e411使用年限较久导致。直接化学发光法的25-羟基维生素D线性区间为10～150 ng/ml,电化学发光法为3～70 ng/ml,经验证在其线性区间范围内线性极好,但二者线性差异较大可能与二者检测方法学不同有关:依据二者试剂检测说明书,虽二者检测均为免疫竞争法,但两个检测平台检测原理不同,其所制备抗体、相应的抗原结合位点及所依托的反应体系技术也不同,导致该检测项目的线性区间有较大差异。由于直接化学发光法线性区间足够大,临床样本很少涉及稀释,因此只对电化学发光法的25-羟基维生素D做了稀释倍数验证,验证后检测范围和直接化学发光法接近。

2种方法的参考区间随差距较大,但也验证通过,推测可能同样由于方法学体系的差异产生。本研究组内相关系数ICC达到了0.925,表现出极好的一致性,与两种方法溯源一致有关:新产业M4000P的25-羟基维生素D校准品溯源为美国国家标准与技术研究院(NIST)标准参考物质SRM972a,而罗氏Cobas e411的25-羟基维生素D可溯源至LC-MS/MS,并可进一步溯源至NIST标准。2种方法的Bland-Altman偏差分析显示出在检测均值偏低范围(7.65～20 ng/ml)结果的一致性更好,随VD检测值增大约>20 ng/ml,偏差增大的可能性增大。这与谭延国[9]对不同化学发光方法检测生长激素的一致性研究基本一致,结果显示随生长激素水平递增,不同方法的检测系统间的水平差异夜呈比例递增。

基于各临床实验室出具的25-羟基维生素D报告单中,同一检测样本涉及到使用的不同方法学的检测项目结果可能会有所差异,为保证检验结果的可比性,应在报告单上备注所使用的检测方法学,以便于不同方法学的检验结果的分析。而对有方法学差异的检测项目,实验室间质量评价及检验结果互认工作也是基于相同检测方法、相同检测仪器甚至是相同试剂,因此对于同一检验项目有不同检验方法的情况应依据各临床医学实验室的具体情况综合分析。