远程缺血预处理对兔脊髓缺血再灌注损伤的保护作用及脑源性神经营养因子表达的影响

秦洋 倪锦萍 康利 仲志栋 王立仁 尹述洲

(上海交通大学医学院附属苏州九龙医院麻醉科,江苏 苏州 215021)

远程缺血预处理(RIPC)是指对缺血耐受能力强的组织或脏器进行短暂的缺血再灌注,以减轻远端组织或脏器随后更严重的缺血损伤〔1〕。研究表明,使用此预处理的方式可以有效减轻缺血再灌注给大脑、心脏、肝脏及肾脏造成的损伤〔2〕。Przyklenk 等〔3〕发现,当发生冠状动脉缺血再灌注时对肢体进行短暂、轻微的缺血再灌注处理后,心肌梗死面积显著减小。RIPC主要通过改善和维持能量代谢、改善微循环、减少自由基产生、抑制炎性因子的激活、抑制细胞凋亡、增强自噬、诱导内源性保护物质的释放等途径对远隔器官起到保护作用〔4～7〕。

临床上胸腹主动脉瘤手术可导致暂时性或永久性的脊髓缺血再灌注(SCIRI) 损伤,其发生率为3%～20%〔8〕。SCIRI损伤的一个主要病理改变是血-脊髓屏障的破坏,该屏障系统的破坏导致了神经功能的进一步损伤。脑源性神经营养因子(BDNF) 是神经营养因子家族成员中的一种,主要在中枢神经系统表达,可以起到加强突触可塑性、促进神经发生、在中枢神经系统发育过程中对神经元的生长、分化和维持其正常生理功能起关键作用〔9〕。目前,RIPC 用于防治 SCIRI 的研究鲜有报道,本实验观察 RIPC 对兔SCIRI损伤的保护作用及BDNF表达水平的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物 日本大耳白兔36只由鼠来宝实验动物有限公司提供,动物批号:SYK2801212,动物合格证号:320730200100014125,雄性,3～4月龄,普通级,体质量2.2～2.5 kg,普通环境饲养,健康状况良好,常规喂养在上海交通大学医学院实验中心,本实验所有环节均符合3R原则,给予动物人道关怀,经医院伦理委员会批准后进行〔SYXK(苏)-2017-0043,IACUC-20170706-05〕。

1.2主要试剂 戊巴比妥钠、青霉素注射试剂(美国Sigma公司);超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)-Px及丙二醛(MDA)试剂盒(南京建成生物公司);BDNF、酶切的半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(Cleaved-caspase)-9和Cleaved-caspase-3抗体(美国Abcam公司);BDNF、Cleaved-caspase-9和Cleaved-caspase-3 mRNA引物(生工生物工程有限公司)。

1.3仪器 BL-420F生物机能实验系统(成都泰盟科技有限公司);小动物专用呼吸机(DH40B,成都泰盟科技有限公司);常用手术器械:如手术剪、精细眼科剪、止血钳、中号及小号镊子、持针器、手术结扎线、1 ml注射器、眼科开睑器、扩胸器等(上海医疗器械有限公司)。

1.4动物造模及分组 采取随机双盲法将大耳白兔分为假手术(S)组、SCIRI组及SCIRI+RIPC组各12只。具体方法:①麻醉方法:静脉推注3%戊巴比妥钠(1.0 ml/kg)及肌肉松弛剂维库溴铵1.0 mg/kg,通过气管插管接动物呼吸机,调节呼吸频率 30 次/min,吸气呼气比为1∶2。维持麻醉采用间断注射3%戊巴比妥钠(0.5 ml/kg)和维库溴铵(0.5 ml/kg)。其间注意监测血压和心电图,注意保暖保持直肠温度38 ℃。手术完毕待动物清醒后拔除气管导管,肌内注射40万U青霉素,放回原笼饲养;②S组仅手术分离腹主动脉;③SCIRI模型建立:沿左竖肌旁纵行切开皮肤,分离腹主动脉。在左肾动脉下2 cm处用弹性硅胶管阻断腹主动脉血流30 min,使其近心端平均动脉压(MAP)稍有升高,远心端MAP降为0 mmHg,然后松开进行再灌注。④RIPC组处理方法:用压迫止血器阻断右侧股动脉近心端5 min;然后松开止血器恢复血流5 min。重复以上操作4次(共40 min);SCIRI+RIPC组则需要在夹闭主动脉前1 h实施RIPC。再灌注第5天后,将各组动物处死。

1.5后肢神经功能评分 实验第5天后采用双盲法由另一名不知道分组情况的人员利用 Tarlov 脊髓损伤改良评分标准〔10〕,对实验动物进行后肢神经功能评分。分数越高,后肢神经功能越好,0～1分:无自主性活动,仅限于非反射性的膝、髋关节运动;2分:膝、髋和踝关节肢体运动;3分:行走时可主动支持体质量,不协调步态或偶见协调步态,4分:行走时前后肢协调步态,偶见趾关节的肢体运动;5分:正常步态。

1.6脊髓组织病理学观察 Tarlov 脊髓损伤改良评分后处死动物,取部分脊髓组织(L4～L5 段),制作苏木素-伊红(HE)染色切片72 张(每个脊髓组织2张),采用双盲法按Naslund分级病理损伤程度评估脊髓组织的损伤〔11〕。Ⅰ级:正常脊髓或神经元偶见少量胞质内颗粒变性或空泡;Ⅱ级:中等程度核染神经元与正常神经细胞之间或缺血性神经元可见胞质尼氏体丢失、胶质细胞核浓缩并增多;Ⅲ级:大量神经元细胞皱缩,核溶解,髓鞘消肿坏死,胶质细胞增多。

1.7脊髓组织中SOD和GSH-Px活性及MDA含量 硫代巴比妥酸比色法检测脊髓组织中MDA水平,黄嘌呤氧化法检测SOD活性,比色法检测GSH-Px活性。取L3～L4 段脊髓组织约100 mg 进行匀浆,离心后取上清,采用相应试剂盒检测氧化应激指标的活性。

1.8脊髓组织BDNF、Caspase-9和Caspase-3 mRNA 表达水平测定 取L3～L4 段脊髓组织利用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)测定BDNF、 Caspase-9和Caspase-3 mRNA 与 GAPDH的相对表达量。利用Trizol法提取细胞总RNA后再利用紫外分光光度计检测RNA的浓度及纯度,参照cDNA合成试剂盒法逆转录合成cDNA再依次检测BDNF、Caspase-9和Caspase-3 mRNA表达水平,内参基因为GAPDH。程序:94 ℃、15 s (变性);58 ℃,15 s(退火);72 ℃,15 s(延伸);40个循环。采用相对定量2-ΔΔCt法计算各组mRNA表达量。基因引物序列(5′-3′):Caspase-3正向:TAAGCCACGGTGATGA AG,反向:CGGCAAGCCTGAATAATG;Caspase-9正向:GAACTTCAGCAGCACCTC,反向:CATTTCCTTGGCGGTCAG;BDNF正向:GATGAGGACCAGAAGGTTCG,反向:GATTGGGTAGTTCGGCATTG;GAPDH正向:CTCCTGCGACTTCAACAGTG,反向:TGAGGG CTCTTACTCCTTGG。

1.9脊髓组织中BDNF、Cleaved-caspase-9和Cleaved-caspase-3蛋白检测 取部分脊髓组织(L3～L5段)制作组织匀浆,按照总蛋白提取试剂盒说明书提取各组总蛋白,采用二喹啉甲酸(BCA)定量,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、再湿转法转膜至聚偏氟乙烯(PVDF)膜,5%脱脂牛奶封闭2 h,加入BDNF、Cleaved-caspase-9和Cleaved-caspase-3(稀释比例:1∶2 000、1∶1 000、1∶1 000)一抗,4 ℃孵育过夜,次日加入二抗稀释液稀释后的二抗(稀释比例:1∶5 000),并在室温孵育摇床1 h,按照高敏感度化学发光检测试剂盒说明书滴加发光工作液显色后,以GAPDH为内参,采用ImageJ软件进行数据分析。

1.10统计学分析 采用SPSS22.0软件进行单因素方差分析、LSD-t检验、χ2检验、秩和检验。

2 结 果

2.1各组动物后肢神经功能评分 实验于第5天结束时,SCIRI组后肢神经功能评分(0分2只、1分6只、2分4只)与S组(4分12只)相比明显降低(Z=1.508、P=0.021);SCIRI+RIPC组的后肢神经功能评分(3分2只、4分10只)与SCIRI组相比增加,但差异无统计学意义(Z=1.916、P=0.055);SCIRI+RIPC组与S组差异无统计学意义(Z=0.360、P=0.999)。

2.2各组脊髓组织病理学变化 S组脊髓组织表现正常,神经元为多角形结构,胞核结构清晰,胞质中尼氏体存在,分布均匀;与S组相比,SCIRI 组脊髓损伤严重,表现为胞核固缩或溶解,胞质呈嗜伊红染色,胞质中尼氏体消失,有的细胞固缩红染明显,可见红色神经元;与SCIRI 组比较,SCIRI+RIPC组脊髓组织病理学改变明显改善。见图1。与S组(Ⅰ级12只)比较,SCIRI+RIPC组第5天病理切片Naslund分级结果(Ⅰ级11只、Ⅱ级1只)均无明显变化(Z=1.063、P=0.208),而SCIRI组(Ⅱ级2只、Ⅲ级10只)有统计学差异(Z=2.047、P<0.001);与SCIRI组比较,SCIRI+RIPC组显著改善(Z=1.921、P=0.001)。

图1 各组脊髓组织病理学变化(HE染色,×200)

2.3各组脊髓组织中MDA水平及SOD和GSH-Px活性 与S组比较,SCIRI组MDA水平明显升高,SOD和GSH-Px活性明显降低(P<0.05);与SCIRI组比较,SCIRI+RIPC组MDA水平明显降低,SOD和GSH-Px活性显著升高(P<0.05)。见表1。

表1 3组脊髓组织中SOD、MDA 和 GSH-Px活性比较

2.4各组脊髓组织中BDNF、Caspase-9和Caspase-3 mRNA水平 与SCIRI组相比,SCIRI+RIPC组脊髓中Caspase-9和Caspase-3 mRNA水平显著下降,而BDNF mRNA水平显著增加(P<0.05);与S组比,SCIRI组脊髓组织中Caspase-9和Caspase-3 mRNA水平显著升高,而BDNF mRNA水平显著降低(P<0.05)。见表2。

表2 3组脊髓组织中BDNF、 Caspase-9和 Caspase-3 mRNA 水平比较

2.5各组脊髓组织中BDNF、Cleaved-caspase-9,Cleaved-caspase-3蛋白水平 与S 组相比,SCIRI组脊髓组织中Cleaved-caspase-9 和 Cleaved-caspase-3 蛋白表达明显升高(P<0.05),BDNF蛋白水平显著降低(P<0.05);与SCIRI组相比,SCIRI+RIPC组Cleaved-caspase 9 和 Cleaved-caspase-3 蛋白表达明显降低,BDNF蛋白水平显著升高(P<0.05)。见表3、图2。

表3 3组脊髓组织中BDNF、Cleaved-caspase-9,Cleaved-caspase-3蛋白表达

图2 各组脊髓组织中BDNF、Cleaved-caspase-9和Cleaved-caspase-3蛋白表达

3 讨 论

在临床工作中,如实施主动脉缩窄、胸腹主动脉瘤、脊柱和骨盆肿瘤等外科手术,为了获得有利的手术视野及控制术中出血,常需阻断主动脉血流。然而阻断主动脉血流超过一定范围会出现SCIRI等并发症〔12〕。既往国内外大量医务及科研人员针对如何有效减少围术期SCIRI的发生开展了许多研究〔13〕,而SCIRI发病率仍较高〔14〕。因此,研究出新的有效的SCIRI防治手段具有十分重要临床意义。本研究结果表明,SCIRI+RIPC组实验动物后肢神经功能评分有改善,而脊髓损伤的病理学表型明显减轻;说明在日本大耳白兔中,RIPC法对SCIRI的防治具有明显作用,提示RIPC的临床转化应用具有重要前景。

此外,本实验还发现,在SCIRI期间,受损的脊髓组织有明显的脂质过氧化反应,产生了过量的活性氧(ROS),从而导致ROS自由基的大量出现。正常机体内需要适量的ROS,然而过量的ROS可以引发一系列的氧化应激反应与脂质过氧化反应,破坏正常DNA结构,导致受损区域出现凋亡或坏死〔15〕。SOD和GSH可以催化组织中ROS,将ROS转变为无毒的氧化物或氧气。彭金亮等〔16〕在探究大鼠脑缺血再灌注时发生,模型组大鼠SOD和GSH水平显著降低,MDA含量显著升高,从而对大脑造成氧化应激损伤。刘溪等〔17〕对缺血性脑卒中大鼠脑组织研究发现,脑卒中大鼠脑内一氧化氮合酶(NOS)和SOD活性显著降低。因此,增强中枢神经系统中SOD和GSH的活性,减少MDA产生可达到防治神经元受损,起到保护神经元的作用。本研究说明,RIPC可以减轻脑组织内氧化应激反应的发生,从而发挥对大脑的保护作用。

BDNF是一类广泛分布于中枢神经系统,对脊髓运动神经元的生长与功能调节发挥着巨大的作用〔18〕。在脑缺血模型中,BDNF可通过稳定细胞内Ca2+浓度、提高蛋白激酶活性、减轻自由基损伤等作用延缓神经元坏死和凋亡,从而发挥保护作用〔19〕。Ziemlińska等〔20〕在脊髓横断的大鼠模型中发现,BDNF可通过增加谷氨酸能和氨基丁酸能的神经传递促进早期运动功能的恢复。本实验说明,RIPC可减轻SCIRI所导致的神经功能障碍,有利于运动功能恢复。相关研究显示,细胞凋亡在许多神经系统疾病中起着重要作用,如阿尔茨海默病和帕金森病、脑缺血再灌注等细胞凋亡主要受Caspase家族蛋白调节。Caspase-3和Caspase-9均为促凋亡基因,正常情况下,无活性的Caspase-3、Caspase-9受到凋亡信号激活,导致DNA裂解,诱发细胞凋亡〔21〕。李晓楠等〔22〕探究血管性痴呆大鼠发病机制中发现,BDNF水平的降低导致Caspase-3、Caspase-9激活,从而导致脑组织发生凋亡,提示BDNF可介导Caspase家族蛋白。李雪莲〔23〕对小鼠黑纹状体系统损伤实验中也有相似的发现,即BDNF可介导Caspase家族蛋白。本研究表明,SCIRI兔脊髓内存在损伤,凋亡细胞增加,但RIPC后,兔SCIRI脊髓组织中Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspase-9表达显著降低,提示RIPC可以减轻脊髓损伤,起到相应的保护作用。

本研究说明,RIPC对SCIRI起到一定的保护作用,其可能原因是通过激活内源性BDNF表达水平的增加,降低凋亡因子的产生从而抑制神经元凋亡发挥相关保护作用。本研究主要在动物模型上对BDNF的表达量进行研究,但BDNF在基因及mRNA水平的表达量变化有待进一步研究。另外,本实验可能为SCIRI的治疗提供一种新的治疗思路,而BDNF在其中如何发挥作用,其具体作用的靶点及通路尚需进一步深入研究。