基于系统生物信息学的鼻咽癌关键预测基因筛选及实验验证

黄子葵 李斐 陈跃洲 刘佳铭 刘嘉俊 蓝素珍

摘要：目的 基于系統生物信息学分析鼻咽癌样本基因芯片数据，筛选鼻咽癌的潜在预测基因，并对其进行实验验证。方法 通过基因表达综合数据库筛选鼻咽癌数据集，通过limma包进行差异分析，加权基因共表达网络包进行加权基因共表达网络分析，绘制韦恩图寻找共同基因，进行基因本体富集分析及京都基因与基因组百科全书通路分析。通过蛋白质互作网络、LASSO回归及非参数检验，进一步挖掘鼻咽癌的生物标志物。通过实时荧光定量PCR和Western blot对鼻咽癌关键预测基因的mRNA及蛋白表达情况进行检测，验证结果。结果 GSE12452数据集上调基因共622个，下调基因共351个，通过limma分析及加权基因共表达网络分析并交集最终获取116个交集基因，通过富集分析，生物过程主要包括细胞增殖及调控、细胞间黏附的调节等，富集于Rap1信号通路、Ras信号通路、肿瘤坏死因子信号通路等通路，经过筛选得到血管生成素2（ANGPT2）、双氧化酶2（DUOX2）、人组织因子Ⅲ（F3）、白细胞介素-15（IL-15）、脂质运载蛋白2、视黄酸受体相关孤儿受体B（RORB）共6个关键基因，实时荧光定量PCR和Western blot实验证明ANGPT2、IL-15的mRNA和蛋白在鼻咽癌细胞中高表达，DUOX2、F3、RORB的mRNA和蛋白低表达。结论 ANGPT2、DUOX2、F3、IL-15、RORB为鼻咽癌的潜在预测分子标志物和治疗靶点，其机制可能与Rap1、Ras、肿瘤坏死因子等信号通路有关。

关键词：鼻咽癌；生物信息学分析；基因表达综合数据库；加权基因共表达网络分析；生物标志物；差异表达基因；关键基因

中图分类号： R739.6文献标志码： A文章编号：1000-503X（2023）04-0597-11

DOI：10.3881/j.issn.1000-503X.15503

Key Prediction Genes of Nasopharyngeal Carcinoma：Screening Based on

Systematic Bioinformatics and Validation by Cell Experiments

HUANG Zikui¹，LI Fei¹，CHEN Yuezhou²，LIU Jiaming³，LIU Jiajun⁴，LAN Suzhen⁵

¹Department of Traditional Chinese Medicine，Ganzhou Peoples Hospital，Ganzhou，Jiangxi 341000，China

²Shenzhen Clinical School of Medicine，Guangzhou University of Chinese Medicine，Shenzhen，Guangdong 518116，China

³The Second Clinical Medical College，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China

⁴Clinical Medical College of Acupuncture Moxibustion and Rehabilitation，Guangzhou University of

Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China

⁵Department of Oncology，Ganzhou Peoples Hospital，Ganzhou，Jiangxi 341000，China

Corresponding author：LAN Suzhen Tel：0797-5889396，E-mail：l18170115016@163.com

ABSTRACT：Objective To screen out the potential prediction genes for nasopharyngeal carcinoma（NPC）from the gene microarray data of NPC samples and then verify the genes by cell experiments.Methods The NPC dataset was downloaded from Gene Expression Omnibus，and limma package was employed to screen out the differentially expressed genes.Weighted correlation network analysis package was used for weighted gene co-expression network analysis，and Venn diagram was drawn to find the common genes.The gene ontology annotation and Kyoto encyclopedia of genes and genomes pathway enrichment were then performed for the common genes.The biomarkers for NPC were further explored by protein-protein interaction network，LASSO regression，and non-parametric tests.Real-time quantitative PCR and Western blotting were employed to determine the mRNA and protein levels of key predictors of NPC，so as to verify the screening results.Results There were 622 up-regulated genes and 351 down-regulated genes in the GSE12452 dataset.A total of 116 common genes were obtained by limma analysis and weighted gene co-expression network analysis.The common genes were mainly involved in the biological processes of cell proliferation and regulation and regulation of intercellular adhesion.They were mainly enriched in Rap1，Ras，and tumor necrosis factor signaling pathways.Six key genes were screened out，encoding angiopoietin-2（ANGPT2），dual oxidase 2（DUOX2），coagulation factor Ⅲ（F3），interleukin-15（IL-15），lipocalin-2，and retinoic acid receptor-related orphan receptor B（RORB）.Real-time quantitative PCR and Western blotting showed that the NPC cells had up-regulated mRNA and protein levels of ANGPT2 and IL-15 and down-regulated mRNA and protein levels of DUOX2，F3，and RORB，which was consistent with the results predicted by bioinformatics.Conclusion ANGPT2，DUOX2，F3，IL-15 and RORB are potential predictive molecular markers and therapeutic targets for NPC，which may be involved in Rap1，Ras，tumor necrosis factor and other signaling pathways.

Key words：nasopharyngeal carcinoma；bioinformatics analysis；Gene Expression Omnibus；weighted gene co-expression network analysis；biomarkers；differentially expressed gene；key gene

Acta Acad Med Sin，2023，45（4）：597-607

鼻咽癌起源于鼻咽黏膜，是一种上皮恶性肿瘤，其在全球范围内具有明显的地理分布特点，其中81%的新发病例发生在亚洲，而非洲只有9%^［1］。关于新诊断患者的数量，2012年排名前5位的国家包括中国、印度尼西亚、越南、印度和马来西亚，占全球鼻咽癌患者的67%^［1］。尽管鼻咽癌的治疗得到了加强，但发病部位隐匿、诊断晚、预后差和转移影响生存率^［2］，死亡率仍居高不下^［3］。放射治疗和综合化疗策略的进步提高了原发性鼻咽癌患者的预后^［4-5］。然而，鼻咽癌具有高恶性复发率，局部组织浸润和远处转移成为放疗失败的主要原因^［6］。有研究通过分析鼻咽癌ceRNA网络，发现鼻咽癌的发生发展可能与核仁纺锤体相关蛋白1等基因有关，富集于丝裂原活化蛋白激酶、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信号通路和凋亡通路^［7］。Zou等^［8］研究显示，Xk1p2靶蛋白、极光激酶A、细胞分裂周期6、有丝分裂停滞缺陷2样1、DNA拓扑异构酶Ⅱα与鼻咽癌发病机制有关，且细胞周期蛋白依赖性激酶1与核输出蛋白1可能是EB病毒致鼻咽癌的重要原因。尽管上述研究均针对鼻咽癌，但其未结合LASSO回归进行分析，且缺乏分子生物学水平的实验验证。目前，鼻咽癌生物学标志物网络尚不完善，因此，进一步挖掘鼻咽癌的相关标志物并对其做出实验验证非常重要。

随着人们对数据挖掘和生物信息学的兴趣与日俱增，基因表达综合（Gene Expression Omnibus，GEO）数据库越来越受到研究人员的认可，一些肿瘤相关基因，包括鼻咽癌相关基因，正在被发现^［9-10］。加权基因共表达网络分析（weighted correlation network analysis，WGCNA）通过利用聚类原理创建基因与疾病表型相关的共表达网络，筛选出与临床信息相关的基因模块，并发现其中的枢纽基因，为探讨疾病的分子机制提供思路^［11］。LASSO回归正则化方法在变量筛选和模型稳定性上具有良好表型，自提出后在医学等领域广泛应用于预测模型构造^［12］。通过二者联用，具有更佳筛选高度相关的预后靶点优势。甘轲等^［13］结合生物信息学方法及临床标本验证，指出驱动蛋白家族成员11和核糖核苷酸还原酶调节亚基M2与肝细胞癌发生发展预后密切相关。修德健等^［14］通过WGCNA分析TCGA和GEO数据库的高通量测序数据，发现有丝分裂停滞缺陷2样1与宫颈癌患者的预后及免疫浸润有关。本研究根据从GEO获得的基因表达谱数据，筛选出差异表达基因，运用WGCNA、LASSO回归和非参数检验，筛选出与鼻咽癌高度相关的靶点，并通过实时荧光定量PCR（real time quantitative PCR，RT-qPCR）与Western blot实验进行验证，为后续深入研究提供证据支持。

资料和方法

生物信息学分析

数据的获取与差异表达基因处理：通过GEO数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）GEO DataSets检索关键词nasopharyngeal carcinoma，并限制种属Homosapiens和研究类型Expression profiling by array，检索共得到61项。选择未经治疗过的鼻咽癌组织样本，且包含鼻咽癌患者与无恶性肿瘤患者的数据集纳入，得到GSE12452，该数据集基于GPL570平台，包括31例Epstein-Barr病毒阳性未分化鼻咽癌患者与10例无恶性肿瘤患者的总RNA样本^［15］。利用R语言limma包对基因数据进行分析，以log2FC≥1且P＜0.05的基因為差异表达基因（differentially expressed genes，DEG），从而得到鼻咽癌组织与正常组织之间的DEG，进一步绘制差异表达基因热图与火山图。

加权基因共表达网络分析：WGCNA通过筛选软阈值β建立无尺度网络，计算模块特征与临床特征之间的相关性，以此识别高度相关的共表达基因模块，并进一步挖掘模块内的枢纽基因，这种方法有利于识别候选生物标志物或治疗靶点。本研究采用全基因一步法构建无尺度网络，选取GSE12452中与患病情况密切相关的模块，提取模块基因构建韦恩图，获取与差异表达基因的交集。

富集分析：将模块基因与差异表达基因所构建韦恩图筛选得到的共同基因导入clusterProfiler包进行基因本体（gene ontology，GO）富集分析及京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析，其中GO分析包括生物过程、分子功能、细胞组分，根据排名进行可视化。

蛋白质互作网络及LASSO回归：蛋白质互作（protein-protein interaction，PPI）网络由蛋白通过彼此间的相互作用构成，其参与生物信号的传递、能量转化、物质代谢、代谢基因表达的调节等重要生命过程。LASSO算法是一种通过构造惩罚函数以压缩部分低权重回归系数进而明确两变量之间的关联程度的回归方法^［16］，有助于从高维变量中筛选具有代表性的变量。本研究通过Cytospace 3.9.0的CytoHubba插件加载PPI网络，识别网络中的关键蛋白，并通过LASSO回归进一步筛选与患病高度相关的hub基因，为后续预测靶点的挖掘提供理论依据。

实验方法

材料与试剂：正常人永生化鼻咽上皮细胞（NP69）、人高转移鼻咽癌细胞系（5-8F）购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心，胎牛血清、杜氏改良培养基、胰蛋白酶购自美国Gibco公司，蛋白裂解液购自上海碧云天生物技术有限公司，Trizol试剂盒、RT-qPCR试剂盒、逆转录试剂盒购自美国Promega公司，Western blot仪器购自美国Bio-Rad公司，兔抗血管生成素2（angiopoietin-2，ANGPT2）、双氧化酶2（dual oxidase 2，DUOX2）、人组织因子Ⅲ（coagulation factor Ⅲ，F3）、白细胞介素-15（interleukin-15，IL-15）、脂质运载蛋白2（lipocalin-2，LCN2）、视黄酸受体相关孤儿受体B（related orphan receptor B，RORB）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶和山羊抗兔二抗IgG 重链和轻链均购自英国Abcam公司。

细胞培养：将NP69、5-8F细胞在含10% 胎牛血清、100 μg/ml链霉素和100 U/ml青霉素的杜氏改良培养基中进行培养，并放置于37 ℃、含5%CO₂的培养箱中，待细胞覆盖至80%后进行传代培养。

RT-qPCR：用Trizol试剂盒提取NP69、5-8F细胞的总RNA，使用逆转录试剂盒进行反转录，进而得到反转录后的cDNA，接着以甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因作为内参，进行目的基因的RT-qPCR检测，表1为引物序列。该方法的循环条件为：首先75 ℃ 2 min，预变性，接着进入以下循环：90 ℃ 5 min，变性；60 ℃ 60 s，退火；72 ℃ 30 s，延伸；共40个循环。采用2^-ΔΔCt法计算ANGPT2、DUOX2、F3、IL-15、LCN2、RORB基因mRNA的表达量。

Western blot：NP69、5-8F细胞培养24 h后，加入含蛋白酶抑制剂的裂解液，于4 ℃ 10 000 r/min（r=60 mm）离心10 min，离心后收集蛋白上清液进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，转移至聚偏二氟乙烯膜，并用5%脱脂牛奶封闭2 h，加入一抗4 ℃孵育过夜；TBST缓冲液洗膜后，加入二抗室温孵育2 h，再次TBST缓冲液洗膜，最后用增强型化学发光试剂曝光并暗室显影。

统计学处理 使用R 4.1.0对数据进行统计，使用Graphpad Prism 9.0进行绘图。计量资料采用t检验，计数资料选用卡方检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

鼻咽癌差异表达基因 将下载数据进行标准化（图1），通过limma包差异处理后获得973个鼻咽癌和正常组织的DEG，这些基因均符合log2FC≥1且P＜0.05，其中，上调基因共622个、下调基因共351个（图2）。

加权基因共表达网络分析 采用WGCNA包读取GSE12452数据，获取与临床信息关联的基因模块。计算各基因模块的相关系数，通过选择软阈值β=7构建无尺度网络，设置模块尺寸最小30个基因，采用皮尔逊相关性分析，对各基因模块与临床信息的相关系数及P值进行计算，此时网络具有良好的相关性及节点间连接度（图3A），并通过scaleFreePlot进行验证，計算可得R2=0.86＞0.80，斜率=-1.71＜0，符合无尺度网络分布（图3B）。利用热图呈现模块与临床信息的相关性（图3C），提取相关系数最高的模块MEyellow（r=-0.87，P＜0.001）为研究对象，提取模块基因进一步分析。

韦恩图 利用在线韦恩图制作平台（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）将WGCNA模块基因和差异表达基因进行交集分析，共获取116个交集基因（图4）。

富集分析 将116个交集基因用于GO富集及KEGG通路分析，使用clusterProfiler包将基因编号转化为ENTREZID，选择OrgDb为org.Hs.eg.db，设定P阈值0.05，进行GO富集分析和KEGG通路分析，并绘制气泡图。结果显示生物过程细胞增殖及调控、细胞间黏附的调节、T细胞活化调节等靶点富集较集中（图5A）；细胞组分胞外区、内膜系统、细胞表面等靶点富集较集中（图5B）；分子功能信号受体、氧化还原酶活性、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸结合等靶点富集较集中（图5C）。富集通路包括Rap1信号通路、Ras信号通路、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）信号通路等（图5D）。

蛋白质互作网络与LASSO回归 通过STRING（https：//cn.string-db.org/）数据库导入交集靶点，设置为默认，网络共包括115个节点，46条边（图6A）；将网络导入Cytoscape 3.9.0软件，应用CytoHubba插件，通过马修斯相关系数算法分析得到前10靶点，包括LCN2、F3、血管细胞黏附因子1、ANGPT2、DNA结合抑制因子1、IL-15、昼夜节律蛋白2、RORB、DUOX2及基本螺旋-环-螺旋家族成员e40（basic helix-loop-helix family member e40，BHLHE40）（图6B）。将上述靶点作为观察变量构建LASSO回归模型，对应的系数值不为0的观察量为选入，筛选出7个鼻咽癌诊断相关基因，包括ANGPT2、BHLHE40、DUOX2、F3、IL-15、LCN2、RORB（图7）。

基因表达对比 通过boxplot可视化ANGPT2、BHLHE40、DUOX2、F3、IL-15、LCN2、RORB在GSE12452数据集的表达情况，并通过t检验进行比较，结果显示除BHLHE40（P=0.053）外，ANGPT2、DUOX2、F3、IL-15、LCN2、RORB在鼻咽癌组与正常对照组差异均有统计学意义（P均<0.001）（图8）。

RT-qPCR实验结果 使用RT-qPCR对鼻咽癌预测基因的mRNA表达情况进行检测。经过实验验证，鼻咽癌组细胞ANGPT2（P=0.002）和IL-15（P=0.005）的mRNA表达显著高于正常对照组鼻咽上皮细胞；而DUOX2（P=0.001）、F3（P＜0.001）、LCN2（P=0.039）、RORB（P=0.024）的mRNA表达均显著低于正常对照组鼻咽上皮细胞（图9）。

Western blot实验结果 使用Western blot对鼻咽癌预测基因的蛋白表达情况进行检测，实验结果进一步证实鼻咽癌细胞相关基因蛋白表达的变化。与正常对照组相比，鼻咽癌组ANGPT2和IL-15蛋白表达增高，DUOX2、F3、RORB蛋白表达降低（图10）。

讨论

鼻咽癌在我国尤其南部地区是一种常见的恶性肿瘤，为深入了解鼻咽癌的发病机制及挖掘其预测基因，本研究基于GEO数据库获得GSE12452数据集，将鼻咽癌样本与正常组织样本进行比较，共发现973个差异表达基因。通过WGCNA获取MEyellow模块与临床发病信息高度相关，从中获取421个基因；二者交集基因共116个，通过分析其富集情况，有助于探讨其发病机制。通过PPI网络、CytoHubba、LASSO回归和统计学非参数检验，挖掘与鼻咽癌发病高度相关的预测基因，并通过RT-qPCR与Western blot实验验证了这些基因的表达。

子G蛋白Ras超家族，在调控细胞增殖、凋亡、细胞黏附等各种生命活动中发挥重要作用^［17］。越来越多的研究揭示了Rap1在前列腺癌、卵巢癌等多种恶性肿瘤发展过程中发挥作用，Rap1通过细胞外调节蛋白激酶/p38、Notch信号通路促进癌细胞转移^［18］；而Xiang等^［19］、Zhang等^［20］通过下调Rap的表达抑制细胞生长、增殖、黏附和侵袭，发挥抑癌的作用^［17］，然而，目前关于Rap1对鼻咽癌的影响研究有限，仍需进一步研究。Ras作为最常见的癌基因之一，与Rap1具有高度的同源性，且在影响下游通路及受体的结构域上具有高度相关性，Ras与其介导的Ras-Raf活化激活下游的细胞外调节蛋白激酶，后者进入细胞核后活化许多转录因子，调控细胞增殖、生存、迁移和凋亡^［21-23］，研究显示其与头颈部、肝、胰、结直肠等肿瘤高度相关，与单纯鼻咽癌5-8F细胞相比，西妥昔单抗干预组Ras蛋白显著升高（P＜0.001），且细胞表现出较慢的生长速度和较低的生长曲线，提示Ras通路不仅影响鼻咽癌细胞增殖^［24］，且可作为鼻咽癌治疗靶点之一。TNF-α通路激活刺激核因子κB和丝裂原活化蛋白激酶活性，诱导肿瘤细胞炎症反应，对体内外多种肿瘤细胞具有明显的细胞毒作用^［25］，促进肿瘤的杀伤作用，与鼻咽癌的进展和预后密切相关^［26-27］。宋启斌等^［28］研究显示，TNF-α通过上调鼻咽癌细胞中凋亡抑制因子的表达而使肿瘤细胞抗凋亡。

通过STRING数据库导入交集靶点，其结果以Cytoscape 3.9.0软件构建PPI网络图，并利用boxplot可视化筛选的基因行t检验，最终得到鼻咽癌的关键预测基因ANGPT2、DUOX2、F3、IL-15、LCN2、RORB。其中ANGPT2是血管生成的关键介质，在肺癌组织中高度表达，且KM曲线证实，高水平的ANGPT2与肺癌低生存率相关^［29］，进一步研究显示，ANGPT2经上调后诱导结肠癌、黑色素瘤转移^［30-31］，而抑制ANGPT2表達发挥抗乳腺癌、黑色瘤免疫作用^［32］，然而，其调节鼻咽癌作用仍未有研究报道，可作为未来深入研究方向。DUOX2是甲状腺激素碘有机过程中的重要调节蛋白，在食管癌、胃癌、结肠癌、胰腺癌等高度表达^［33］，并促进胰腺癌、结直肠癌细胞增殖和转移^［34］，是永久性先天性甲状腺功能减退症最常见的突变基因^［35］。F3参与许多细胞内信号、细胞存活、基因和蛋白表达、增殖等机制^［36］，其表达受TNF-α等信号通路调控^［37］，是多种细胞的表面受体，通过抑制F3表达，可显著降低卵巢癌细胞增长率和Ki-67水平，减少侵袭细胞数量^［38］。IL-15是一种细胞因子，具有调节先天性免疫反应及适应性免疫反应的功能^［39］，研究表明IL-15高表达的胸腺上皮肿瘤患者总生存期及无进展生存期显著缩短，IL-15可参与胸腺上皮肿瘤的发生、发展，作为患者预后的独立危险因素^［40］。LCN2是一种分泌型糖蛋白，与多种生理功能有关，包括调节免疫反应、维持铁稳态等^［41］，作为一种高度保守的分泌型脂肪因子，在卵巢癌、甲状腺癌、肺癌等肿瘤中高表达；LCN2的低表达与具核梭杆菌促进结直肠癌细胞的增殖及侵袭能力有关^［42］，是许多癌症治疗的潜在治疗靶点。RORB是一种蛋白质编码蛋白，研究显示其与昼夜节律相关基因表达调节有关，通过纳入49 402例受试者病例对照研究，RORB等位基因携带者增加了乳腺癌发生率（OR=1.87）^［43］，另有研究显示RORB可能通过调控细胞周期、细胞增殖和分化等影响肿瘤形成，其胃癌组织中为低表达^［44］。然而，尽管上述基因已有研究报道在多种恶性肿瘤均发挥重要作用，但其对鼻咽癌的影响鲜见报道，可作为未来研究方向。

综上，本研究通过对GSE12452数据集进行差异分析及加權基因共表达网络分析，挖掘既有临床相关性又具有表达差异性的交集基因。通过富集分析，交集基因主要富集于细胞增殖、细胞间黏附的调节等生物功能，与Chen等^［45］报道的鼻咽癌“高转移潜力”不谋而合，且主要富集于Ras、Rap1、TNF-α通路。为进一步挖掘鼻咽癌的潜在生物标志物，本研究通过PPI网络、LASSO回归及统计学差异分析，筛选得到ANGPT2、DUOX2、F3、IL-15、LCN2、RORB共6个基因。并通过RT-qPCR验证了ANGPT2、IL-15的mRNA在鼻咽癌细胞中高表达，DUOX2、F3、LCN2、RORB的mRNA为低表达；通过Western blot验证了ANGPT2、IL-15表达的蛋白在鼻咽癌细胞中高表达，DUOX2、F3、RORB表达的蛋白为低表达，表明这5个基因有望成为鼻咽癌的诊断分子标志物和治疗靶点，为鼻咽癌的诊断与治疗提供新的思路与实验基础。

参 考 文 献

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（收稿日期：2023-01-19）