一株淡紫拟青霉PT1菌株的培养特性及生物学特性

唐慧

贵州林业勘察设计有限公司，贵州 贵阳 550000

1 前言

1.1 淡紫拟青霉简介

淡紫拟青霉 (Paecilomyces lilacinus) 在Answorth（1973）系统中属于半知菌亚门丝孢纲丝孢目丛梗孢科拟青霉属[1]。菌丝体发达，呈疏松棉絮状，分生孢子直接从菌丝或分生孢子梗上产生，分生孢子梗不形成孢梗束或分生孢子座。至今该属报道有近50 个种，皆为昆虫病原菌和线虫病原菌，是一些植物寄生线虫的重要天敌，能寄生于卵，也能侵染幼虫和雌虫，可明显减轻多种作物根结线虫、孢囊线虫、茎线虫等植物线虫病的危害。淡紫拟青霉广泛分布于全世界各地，具有功效高、寄主广、易培养等优点。

1.2 实验研究背景

松材线虫病，即松树萎蔫病，其病原为嗜木伞真滑刃线虫(Bursaphelenchus xylophilus)[2]，其传播蔓延速度快、防治难度大，又被称为松树癌症、无烟的森林火灾[3]。松材线虫在世界广泛分布，是继榆枯萎病、板栗疫病、松针疱疹锈病之后的第四大森林病害，属于特大毁灭性灾害，被列为森林病虫害之首[4]，对森林资源以及经济造成了严重的影响。有研究发现，用淡紫拟青霉PT1 菌株的发酵液处理松材线虫，其24h、48h、72h 的校正死亡率都高达100%，表现出较强的杀松材线虫的能力[5]。研究淡紫拟青霉PT1菌株的培养特性对研究防治松材线虫有着重要的意义。

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 实验菌株来源

该实验所用淡紫拟青霉PT1 菌株来源于中国林科院微生物菌株平台，前期试验证明其对松材线虫杀虫高效菌株。

2.1.2 实验药品

琼脂、硫酸镁、磷酸二氢钾，葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、淀粉、甘露醇、牛肉膏、蛋白胨、硫酸铵、酵母膏。

2.2.3 实验器材

表1 试验所用仪器设备Tab.1 Instruments and Equipment Used in the Test

2.2 实验方法

2.2.1 不同温度对淡紫拟青霉PT1 菌株生长的影响

用改良PDA 培养基（培养基成分：马铃薯200g、水1000mL、琼脂20g、葡萄糖20g、磷酸二氢钾3g、硫酸镁1.5g）培养淡紫拟青霉PT1 菌株。设置5 个温度梯度，分别为15℃、20℃、25℃、30℃、35℃；每个温度做5 个重复，重复3 次。在温箱避光培养7d，用十字交叉法测量菌落直径，每24h 测量1 次，并记录测量的结果，比较各个温度的菌落生长状况，筛选出使淡紫拟青霉PT1 菌株生长状况最好的温度。

2.2.2 不同碳源对淡紫拟青霉PT1 菌株生长的影响

以改良PDA 为基础培养基，配方同上。替换碳源，供试碳源有：麦芽糖、蔗糖、乳糖、淀粉、甘露醇；每个碳源做5 个重复，重复3 次。在温箱28℃避光培养7d，用十字交叉法测量菌落直径，每24h 测量1次，并记录测量结果，比较各个碳源的菌落生长状况，筛选出使淡紫拟青霉PT1 菌株生长状况最好的碳源。

2.2.3 不同氮源对淡紫拟青霉PT1 菌株的生长影响

以改良PDA 为基础培养基，培养基配方同上。供试氮源有：蛋白胨、牛肉膏、硫酸铵、酵母膏；每个氮源做5 个重复，重复3 次。在温箱28℃避光培养7d，用十字交叉法测量菌落直径，每24h 测量1 次，并记录测量的结果，比较各个氮源的菌落生长状况，筛选出使淡紫拟青霉PT1 菌株生长状况最好的氮源。

2.2.4 不同pH 对淡紫拟青霉PT1 菌株的生长影响

以改良PDA 为基础培养基培养淡紫拟青霉PT1菌株，培养基配方同上。设置6 个pH 梯度，分别为pH4、pH5、pH6、pH7、pH8、pH9；每个pH 做5 个重复，重复3 次。在温箱28℃避光培养7d，用十字交叉法测量菌落直径，每24h 测量1 次，并记录测量结果，比较各个pH 的菌落生长状况，筛选出淡紫拟青霉PT1菌株生长状况最好的pH。

2.2.5 淡紫拟青霉PT1 菌株菌落观察

用改良PDA 培养基（配方同上）培养淡紫拟青霉PT1 菌株，温箱28℃避光培养，每天观察菌落的颜色、大小、质地、形状、纹路等，并记录观察结果，拍照。观察7d，设置5 个重复。

2.2.6 淡紫拟青霉PT1 菌株产孢时间的观察

用改良PDA 培养基（配方同上）培养淡紫拟青霉PT1 菌株；每天用接种针挑取少许菌丝置于滴有水滴的载玻片上，盖上盖玻片，置于光学显微镜下观察是否有孢子的产生，并拍照，记录产孢时间以及孢子的形态。

3 结果与分析

3.1 温度对淡紫拟青霉PT1 菌株生长的影响

温度对淡紫拟青霉PT1 菌株的生长影响较大，温箱避光培养7d 后，结果显示：当温度为30℃时，淡紫拟青霉PT1 的菌落直径较其他几个温度是最大的，其生长到第7 天的菌落直径为4.25cm，其次是20℃、25℃，其淡紫拟青霉PT1 菌株的菌落直径分别为3.61cm、3.45cm，但温度在35℃时，淡紫拟青霉PT1 菌株的菌落直径为1.82cm，是生长状况最差的。从图1 的曲线图可以看出，代表30℃的曲线最陡，表明淡紫拟青霉PT1 菌株在30℃时，菌株的生长速度最快；代表35℃的曲线则特别平缓，菌株的生长速度特别缓慢，几乎没怎么生长。综上所述，淡紫拟青霉PT1 菌株在30℃时，生长状况最好，在35℃时，生长速度特别缓慢，在前6d，25℃的比20℃的生长状况要好，在第7 天时，20℃下培养的淡紫拟青霉PT1 菌株比25℃下培养的淡紫拟青霉PT1 菌株快，原因可能是由于25℃的温箱在中途没有关好门，导致温箱内实际温度降低，不到25℃，导致生长速度减缓，可能是20℃时，淡紫拟青霉PT1 菌株才开始快速生长，具体原因有待继续研究。

图1 不同温度菌株生长直径随时间变化Fig.1 Variation Diagram of Growth Diameter of Strains at Different Temperatures with Time

3.2 碳源对淡紫拟青霉PT1 菌株生长的影响

在葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖、乳糖、淀粉这6 种碳源中，菌株均可生长（图2）。由于淡紫拟青霉PT1 菌株生长缓慢，所以当菌株生长到第7 天时仍未长满培养皿。28℃温箱培养7d 后，不同碳源的培养基上的淡紫拟青霉PT1 菌株的生长情况不同。由图2 可以看出，当淡紫拟青霉PT1 菌株生长到第7天时，由蔗糖作为碳源的培养基培养的淡紫拟青霉PT1 菌株的菌落直径为最大，菌落的最大直径为4.78cm；由葡萄糖作为碳源的培养基培养的淡紫拟青霉PT1 菌株的菌落直径是相对最小的，培养到第7 天的菌落直径为3.35cm。由图2 的曲线图可以看出，代表蔗糖的曲线较陡，则说明在以蔗糖为碳源的培养基上，淡紫拟青霉PT1 菌株的生长速度较其他碳源快；而代表葡萄糖的曲线比较平缓，则说明在以葡萄糖为碳源的培养基上，淡紫拟青霉PT1 菌株的生长较其他碳源缓慢。综上所述，在供试的6 种碳源中，最适合淡紫拟青霉PT1 菌株生长的碳源是蔗糖，不适合淡紫拟青霉PT1 菌株生长的碳源为葡萄糖。

图2 不同碳源菌株生长直径随时间变化Fig.2 Variation Diagram of Growth Diameter of Strains with Different Carbon Sources with Time

3.3 氮源对淡紫拟青霉PT1 菌株生长的影响

菌株在供试氮源培养基上均能生长（图3）。不同氮源对淡紫拟青霉PT1 菌株生长的影响较大，28℃下培养7d 后，不同氮源培养基上的淡紫拟青霉PT1 菌株生长差异较明显。由图3 可以看出，在氮源为牛肉膏的培养基上淡紫拟青霉PT1 菌株生长最好，菌落直径为4.47cm；其次为以酵母膏为氮源的培养基上淡紫拟青霉PT1 菌株，菌落直径为3.98cm；以蛋白胨为氮源的培养基上淡紫拟青霉PT1 菌株，菌落直径为3.80cm；直径最小的是以硫酸铵为氮源的培养基上生长的淡紫拟青霉PT1 菌株，其菌落直径为2.95cm。由图3 可以看出，牛肉膏的曲线较陡，说明淡紫拟青霉PT1 菌株在以牛肉膏为氮源的培养基中生长速度较其他氮源快；代表硫酸铵的曲线明显比较平缓，则说明淡紫拟青霉PT1 菌株在以硫酸铵为氮源的培养基上的生长速度较缓慢。综上所述，在供试4 种氮源中，淡紫拟青霉PT1 菌株在以牛肉膏为氮源的培养基中的生长状况是最好，而在以硫酸铵为氮源的培养基中淡紫拟青霉PT1 菌株的生长状况是4 种氮源中最差的。

图3 不同氮源菌株生长随时间变化直径Fig.3 Diameter Diagram of Growth of Strains with Different Nitrogen Sources with Time

3.4 pH 对淡紫拟青霉PT1 菌株生长的影响

菌株在试验所设置的pH 范围内都能生长（图4）。不同的pH 对淡紫拟青霉PT1 菌株生长的影响各不相同。由图4 的柱状图可以看出，当pH 为8 时，淡紫拟青霉PT1 菌株的菌落直径是最大，菌落直径为4.25cm；其次是pH 为7 时，淡紫拟青霉PT1 菌株的菌落直径，其菌落直径为4.23cm，两者相差不大。但pH 为4 时，淡紫拟青霉PT1 菌株的菌落生长情况最不理想，其菌落直径在第7 天时为2.48cm。由图4可以看出，代表pH4 的曲线较平缓，说明淡紫拟青霉在pH 为4 的培养基上生长状况不好；代表pH8 的曲线比较直且陡，说明在pH 为8 的培养基上淡紫拟青霉PT1 菌株的生长速度较均匀且较快；pH 为7 的培养基的在第3 天到第6 天时，淡紫拟青霉PT1 菌株的生长状况比pH 为8 时的要好，但pH7 的生长速度不均匀，第6 天到第7 天时生长速度有所下降；代表pH9 曲线比较直，说明在pH 为9 的培养基上生长的淡紫拟青霉PT1 菌株的生长速度比较均匀。综上所述，淡紫拟青霉PT1 菌株适合在偏碱性的环境中生长，且生长速度较快，不适合在偏酸性的环境下生长，其生长的最适pH 范围为7～8。

图4 不同pH 菌株生长随时间变化直径Fig.4 Diameter Diagram of Growth of Strains with Different pH Values Changing with Time

图5 淡紫拟青霉PT1 培养形态Fig.5 Culture Morphology of Paecilomyces lilacinus PT1

3.5 淡紫拟青霉PT1 菌株的菌落形态观察

用改良PDA 培养淡紫拟青霉PT1 菌株，28℃避光培养，每天用肉眼观察淡紫拟青霉PT1 菌株的菌落形态，观察发现淡紫拟青霉PT1 菌株起初菌落颜色为白色，菌丝呈放射状向四周均匀扩散，因此其菌落形状为均匀的圆形，菌落质地呈疏松棉絮状，淡紫拟青霉PT1 菌株的生长速度较缓慢，所以培养10d后仍然没有长满培养皿。在淡紫拟青霉PT1 菌株长到20d 左右时，菌落颜色开始变化从白色变为淡紫色，逐渐长满培养皿。

3.6 淡紫拟青霉PT1 菌株产孢时间的观察

用改良PDA 培养淡紫拟青霉PT1 菌株，28℃避光培养。每天在超净工作台内用接种针挑取少许菌丝在滴了水的载玻片上，盖上盖玻片，置于光学显微镜下用40 倍镜观察孢子。在培养到4d 时，在光学显微镜下观察到有孢子的产生，有的分生孢子直接着生于菌丝上，有的分生孢子着生于分生孢子梗上，在显微镜下观察到菌丝接近透明，分生孢子透明，近圆形，分生孢子梗较粗壮。产生分生孢子时的菌落形态如图6，分生孢子如图7。

图6 产生分生孢子时的菌落形态（第4 天）Fig.6 Colonial Morphology of ConidiaGermination(4th days)

图7 分生孢子形态Fig.7 Conidia Morphology

4 结论与讨论

该试验研究了淡紫拟青霉PT1 菌株培养特性，实验结果表明，能使淡紫拟青霉PT1 菌株生长的最佳碳源为蔗糖，最佳氮源为牛肉膏，最适生长温度为30℃，最适生长pH 为7～8，淡紫拟青霉PT1 菌株初期没有长满培养皿时的菌落颜色为白色，培养20d左右，菌落也逐渐长满了培养皿，菌落颜色也从白色变为淡紫色，菌丝呈放射状向四周扩散，菌落现状为圆形，菌落质地为疏松棉絮状，其分生孢子无色近圆形，直接着生在菌丝上，或者着生在分生孢子梗上，淡紫拟青霉PT1 菌株在35℃时几乎不生长，生长速度及其缓慢，在偏碱性的环境下生长较好。李芳等人[6]也对淡紫拟青霉的培养特性进行了研究，结果显示淡紫拟青霉NH-PL-03 菌株在发酵过程中，pH 是相对稳定的，在快速生长时pH 下降，在培养到第7天至第9 天时，pH 回升，并且维持在6～7，碳源的消耗量随着菌丝生长液在逐渐增加。彭鑫等人[7]对玫烟色拟青霉QH-4 的形态特征，分生孢子的萌发环境条件进行了研究，研究结果显示其分生孢子在可萌发的pH 范围较大，在pH5～pH11 条件下都可萌发，但偏酸或者偏碱都会导致其萌发率降低，其分生孢子萌发的最适温度范围为25℃～27℃，生长条件较宽松与淡紫拟青霉PT1 菌株相比，对生长环境的酸碱度和温度的要求不高。夏振远等人[8]采用正交试验研究了淡紫拟青霉IPC 菌株的发酵培养基，其研究结果发现适当增加通气量，pH 控制在5～6，温度控制在29℃更适合淡紫拟青霉IPC 菌株液体的深层发酵，该研究还发现了适合淡紫拟青霉IPC 菌株发酵培养的最佳培养基的配方，蔗糖+ 黄豆粉+0.005g/L FeSO4·7H2O+0.008g/L MnSO4+0.002g/L H3BO3+0.005g/L ZnSO4+0.004g/L CuSO4+ 0.004g/L Na2MoO4+0.002g/L CoCl2+0.04g/L 肌醇为最佳培养基配方，其最佳生长碳源和淡紫拟青霉PT1 菌株一样，也为蔗糖。周靖等人[9]则以查实培养基为基础，采用正交试验研究淡紫拟青霉的培养条件，其研究结果显示，最佳碳源为蔗糖，最佳氮源为硝酸铵，最佳pH 范围为5～6，最佳温度为30℃，与淡紫拟青霉PT1 菌株的最佳碳源和最佳温度是相同的。大量的研究显示，淡紫拟青霉对根结线虫的防治效果好，而淡紫拟青霉防治松材线虫的研究少之又少，而有研究发现淡紫拟青霉对松材线虫也有较高的防治作用[5]，所以研究淡紫拟青霉PT1 菌株的培养特性对防治松材线虫有促进作用，也是该实验的创新点，该实验的不足之处在于研究的不够深入，碳氮源的种类较少，可采用正交实验研究适合淡紫拟青霉PT1 生长的最佳培养基。