泌尿生殖道支原体的实验室检测方法及其进展

覃元锋

【摘要】  近年来，由支原体引起的泌尿生殖道感染呈上升趋势，且耐药菌株逐年增加。如何快速、简便、准确地对引起泌尿生殖道感染的主要病原体一泌尿生殖道支原体进行检测，是临床实验室工作者的重要研究课题之一。本文对国内泌尿生殖道支原体的实验室检测方法现状作一综述，为临床实验室选择适合的泌尿生殖道支原体检测方法提供参考，并期待更为简便、快速和准确的检测方法出现。

【关键词】  泌尿生殖道支原体；检测方法；现状；进展

中图分类号：R446.5        文献标识码：A

文章编号：1672-1721（2023）13-0123-03

DOI：10.19435/j.1672-1721.2023.13.038

近年来，由支原体引起的泌尿生殖道感染呈上升趋势，且由于国内长期以来存在着抗生素不合理应用现象，导致耐药菌株逐年增加[1-2]。因此，如何快速、准确地检测出泌尿生殖道支原体，为临床提供鉴定及药敏试验结果是临床检验微生物实验室工作人员面临的一个难题。本文就目前泌尿生殖道支原体的实验室检测方法综述如下，为临床实验室选择适合的检测方法提供参考。

1    支原体的概念及特点

支原体（mycoplasma）是一群介于细菌和病毒之间，有独立的细胞结构，但缺乏细胞壁而呈现出高度多形性的最小的一种原核细胞型微生物，常见的细胞形态为球形、球杆状或丝状，个体极为微小，大小一般低于1.0 μm。其能够通过滤菌器，是目前所知道的能够在人工培养基中生长繁殖的最小微生物，因其缺乏细胞壁的特性，导致针对细胞壁合成的青霉素等抗生素无效[3]。

支原体在自然界广泛存在，是人体的常居菌群之一，即可以作为正常菌群寄居在人体内，也可以引起人类的各种感染。目前已知的支原体共有80余种，但临床上最常见的致病性支原体是解脲型支原体（ureaplasma uralyticum，Uu）、人型支原体（mycoplasma hominis，Mh）和生殖支原体（mycoplasma genitalium，Mg），三者合称为泌尿生殖道支原体（MG），约占非淋性尿道炎的20%～30%[4]。自1980年首次从人体内分离出泌尿生殖道支原体后，随着研究和检测方法的深入，由泌尿生殖道支原体引起的感染真实而广泛地展现在人们面前[5]。

泌尿生殖道支原体不仅可引起男女性非特异性尿道炎、慢性前列腺炎、附睾炎和阴道炎等疾病，也是造成女性不孕不育和流产的重要原因之一[6-9]。据相关资料显示，泌尿生殖道支原体的感染与不洁性行为有关[10-11]。

2    支原体的直接染色和镜检

在较早的临床检验中，一般是把临床送检的尿道拭子、阴道拭子、宫颈分泌物等标本直接进行涂片，待涂片晾干后按常规方式进行灭活固定，然后进行染色。常用的染色方法一般采用革兰染色或Giemsa染色，但革兰染色不易着色，常常导致在镜下难以清晰地观察到支原体；Giemsa染色呈现出紫蓝色，在镜下呈现出各种不规则的形态。

由于送检的标本多为非无菌标本，混杂着人体组织碎片、人体分泌物和众多的其他微生物等异物，导致镜下难以分辨出支原体，从而极大地降低了阳性检出率，特异性较差，无较大的检测意义，因此只可以作为提示作用，现临床实验室已很少使用[12]。

随着技术的发展，除了光学显微镜之外，电子显微镜、原子力显微镜、扫描显微镜等技术的出现极大地提高了分辨率水平。借助这些显微镜不仅能够观察到支原体的超微结构，并且能够直接观察到支原体所致的机体组织病理改变情况，具有操作简便、快速、需要标本量少、试验耗材成本低等优点，但由于这些显微镜价格昂贵，对操作者的技术水平要求较高，因此难以在临床实验室进行推广。

3     分离培养法

3.1    液体培养法    液体培养法是WHO推荐使用的首选检测方法[1]，该方法对日常培养环境要求不高，操作简便，能够同时获得鉴定和药敏试验结果。其原理是泌尿生殖道支原体在生长过程中产生的尿素酶分解尿素或精氨酸产生碱，使培养基的pH值升高，进而导致培养基中酚红指示剂变为红色来判断培养结果。

由于液体培养法方便快速，且具有较高准确性等特点，自上世纪90年代法国梅里埃公司生产出了支原体IST检测试剂盒后，国内纷纷跟进，2000年左右已广泛应用于临床，可于48 h内获得Uu和Mh的鉴定和药敏试验结果[3]，但該试剂盒未支持Mg的鉴定和药敏试验。值得一提的是：Uu可以形成生物膜，改变细胞膜的通透性，进而提高对抗生素的耐药性[13-15]。由于临床上常用的检验标本为宫颈分泌物或男性尿道分泌物，极易混杂有其他细菌，因此常常造成假阳性导致培养结果偏高，这是目前难以解决的问题。

泌尿生殖道支原体由于细胞壁缺陷，天然耐受所有的β-内酰胺类、磺胺类和利福平等抗生素，对大环内酯类、林可霉素、红霉素和克林霉素也因菌种的不同而呈现出不同的耐药性[12]。

3.2    固体培养法    支原体对营养的要求较高，对低渗透压敏感，除与常见细菌一样需要基础营养物质之外，还需要加入10%～20%的马或小牛血清、酵母浸液、青霉素G和pH指示剂等。但马凤玲[16]报道在耐青霉素菌株存在的情况下，耐药菌株可以无视培养基中青霉素G的抑制而大量繁殖，进而导致支原体培养的阳性率降低。

固体培养能够在培养基上培养出支原体“油煎蛋”样特征性的菌落，以及其独特棕褐色颗粒菌落特征，培养结果直观而准确，因此被视为泌尿生殖道支原体检测方法的“金标准”。

在上世纪80年代，Tully等创建了SP-4培养基，首次从男性尿道分泌物中培养分离出生殖道支原体，为临床实验室提供了一种实用的生殖道支原体检测方法[17-19]。后来Davies等在SP-4培养基的基础上进行了一定程度的改良和优化，促进生殖道支原体的生长，能够在3 d左右获得生殖道支原体菌落。由于Uu培养所需的pH值范围为5.5～6.5，较其他生殖道支原体低，因此配制Uu培养基时应注意，以免影响Uu的检测阳性率[20]。

4    免疫学检测方法

支原体免疫学检测方法在临床实验室中常用的有凝集反应、补体结合试验和酶联免疫吸附试验等，虽然试验方法众多，但本质上不是使用抗原检测抗体，就是使用抗体检测抗原，应用最多的检测方法是使用抗原检测患者体内存在的抗体。Taylor-Robinson等报道应用间接MIF检测非淋球菌性泌尿生殖道炎是一种具有高度敏感性、特异性，并且简便易行的检测方法[21]。Jensen等使用EIA检测男性血液样本中的MG抗体，但检测效果不理想[22]。每一种试验方法均有其特点和不同的针对性，例如代谢抑制试验适用于Mh和Mg的检测，但不适用于对Uu感染的检测[2，23-24]。

由于人体正常寄居着口腔支原体、咽支原体等众多的支原体，导致人体内存在着不同强度的支原体抗体，而这些支原体抗体与Uu感染产生的抗体在目前科学技术下难以区分，且检测的抗体均为定性检测，未能进行定量检测，从而导致检测结果缺乏特异性，在临床上只存在指导性意义，无确诊意义，有误导临床的可能[25]。

虽然免疫学检测方法具有操作简便、检测时间短等优点，但至今没有适合的血清学检验方法能够达到确诊的效果。

5    分子生物学方法

5.1    DNA探针技术    DNA探针技术是通过直接检测病原体的特异性DNA从而判断出病原体的存在与否。1988年人们使用该技术检测男性患者尿道中的生殖道支原体获得良好的效果，由于该技术具备省时、省力、有较高的敏感性和特异性，能够解决免疫学检测方法上难以区分交叉抗体的问题等优点，使其迅速地在世界范围内推广使用，也逐渐成为临床实验室的重要检测手段之一[18]。

5.2    聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）由Mullis于1983年发明，现已广泛应用于临床实验室。其工作原理类似于DNA的天然复制，通过对处理过的标本进行变性—退火—延伸等扩增，能够在较短的时间内将靶核酸扩增放大几百万倍，进而检测出特定的检测目标。

PCR检测技术是目前临床上公认的检测支原体的最佳方法，灵敏度和特异性均较高，而且具有快速、简便等特点[12，26]，但对标本的要求较高，容易受到污染的影响导致结果出现假阳性，这是目前需要解决的难题之一。欧洲[27]和英国[28]推荐男性采用首段尿液进行检测，与我国临床实验室常用的男性尿道拭子不同，两种标本的准确性和特异性对比目前国内报道还是不多。英国[29]推荐女性标本采用阴道拭子，但国内使用宫颈拭子居多。

基于PCR技术发展起来的FQ-PCR、SAT、LAMP和RDB等检测技术，除了具备原PCR技术的特点之外，还具有一定的创新性，也逐渐成为实验室检验的重要技术[12]。尤为值得一提的是LAMP，该技术是采用基因扩增与免疫层析技术相结合建立起来的一种Uu检测方法，除具备PCR技术的优点，该技术还不需要昂贵的特殊仪器，且试剂价格更为低廉，适用于广大基层医院开展[1]。

6    质谱仪检测技术

基质辅助激光解吸电离飞行時间质谱技术（MALDI-TOF MS）是近年发展起来的一种检测方法，可以对培养出来的菌落进行快速鉴定，结果准确可靠，操作简便，成本较低，虽然目前在检测支原体耐药性方面对药物检测的种类有限，但随着技术的发展和质谱仪的普及，其必然成为临床实验室检测泌尿生殖道支原体的常用方法[29]。

由泌尿生殖道支原体引起的感染在临床表现上缺乏特异性，因此其诊断依赖于临床实验室检验结果。目前国内检测泌尿生殖道支原体的试验方法众多，但培养法是公认的金标准，而由于培养的困难性，临床上应用最多的还是商品化的支原体鉴定、药敏试剂盒。在已经建立了PCR实验室的医院基本上都开展了泌尿生殖道支原体检测，但每种检验方法均存在着一定的不足，期待更为快速、简便和准确的检验方法出现。

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（收稿日期：2023-02-23）