细胞焦亡在脑出血发病机制中的研究进展

乔颖,袁月,徐三鹏,李萍

(长春中医药大学基础医学院,长春 130117)

脑出血(intracerebral hemorrhage,ICH)指的是原发性非严重外伤性脑实质内出血,流行病学调查结果表明,ICH在整个脑卒中的占比不高,为10%～15%[1],但它的高致残率和死亡率不容忽视。ICH损伤包括原发性损伤和继发性损伤,前者主要由血肿扩张所致;而后者指因出血后的炎症反应、血-脑屏障损伤及形成血肿周围水肿而导致的一系列脑损伤[2]。诸多因素触发ICH后形成的多种病理生理机制,导致血肿周围和脑部偏远区域的细胞大量死亡,尤其以神经细胞居多,关于神经细胞的损伤,细胞焦亡就涉及其中[3]。本文总结关于ICH诱导的细胞焦亡的相关知识,结合患者的临床症状,探讨减少ICH后细胞焦亡的策略,以改善患者生活质量。

1 细胞焦亡

细胞焦亡是一种经由caspase-1/4/5/11等炎症小体触发的程序性死亡的炎症方式。细胞焦亡对细胞造成不可逆的损伤,使其肿胀、细胞膜裂解、染色质破裂并活跃细胞内促炎因子促进分泌。作为众所周知的蛋白酶caspase-1,可促使白细胞介素18(interleukin-8,IL-18)与白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)的无活性前体至成熟状态,最终导致细胞焦亡,这是最先发现也是主要的焦亡途径[4]。

1.1 细胞焦亡的发现

细胞焦亡最早是在1992年由Zychlinsky等[5]于弗氏志贺氏杆菌感染的巨噬细胞中发现。19世纪初,Bergsbaken等[6]发现沙门氏菌破坏巨噬细胞并使其快速死亡,后期讨论死亡原因不是来源于细胞感染,而是由于caspase-1产生的细胞毒性所致,他们将这类特殊的程序性细胞死亡定义为细胞焦亡。Miao等[7]研究出单核细胞和巨噬细胞中包含的caspase-1可介导细胞焦亡,之后Matikainen等[8]发现,caspase-4、caspase-5及caspase-11与细胞焦亡同样具有相关性,而caspase-1与caspase-4/5/11并不同源,可以看出caspase家族与细胞焦亡息息相关。

1.2 细胞焦亡与细胞凋亡

两者在形态学和生化特性两方面表现不一,具体在DNA损伤程度、核固缩大小及caspase的依赖性上有所体现。(1)两者具有各自特定的DNA损伤程度及损伤形式。细胞焦亡发生后DNA碎片是随机的且细胞核保持完整[9]。对于细胞凋亡而言,DNA酶(caspase activated Dnase,CAD)经由caspase活化并在CAD伴侣蛋白(inhibitor of caspase-activated Dnase,ICAD)抑制CAD的共同作用下损伤DNA,破坏细胞核。其中caspase-1虽然可以裂解CAD,但其并不参与细胞焦亡过程。(2)细胞焦亡的特征性表现在质膜破裂、细胞肿胀和溶解3个方面。caspase-1/11诱导消皮素D(gasdermin D,GSDMD)活化后,细胞膜迅速遭到破坏[10],因此,在细胞膜的完整性方面,焦亡细胞处于劣势。(3)关于激活触发细胞凋亡和细胞焦亡的效应caspase,caspase-3/6/7/8/9/10发生在细胞凋亡中。细胞焦亡大多数依赖caspase-1/11来诱导进行。(4)三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)水平可调控凋亡细胞,DNA损伤后多聚三磷酸腺苷-核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase,PARP)可以被激活从而消耗ATP。因此,为了维持ATP水平,caspase可裂解和下调PARP从而调控凋亡细胞,值得一提的是,虽然caspase-1能裂解PARP,但是PARP并不参与细胞焦亡[11]。

1.3 细胞焦亡的2种机制途径

细胞焦亡的2种机制途径分别是caspase-1介导的经典型炎症途径和caspase-4/5/11介导的非经典型炎症途径[12]。在第一种途径中,细胞膜中的损伤相关模式分子(deoxyadenosine monophosphate,DAMP)会活化caspase-1,激活GSDMD释放其N末端产物(GSDMD-N),引起细胞焦亡。而对于第二种途径,炎症因子和caspase-1并不参与,同样是依赖GSDMD,裂解GSDMD的任务主要是由caspase-4/5/11通过细胞质脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)激活后完成。

1.3.1 经典细胞焦亡途径分子机制 在该途径初期,Toll样受体与核苷酸结合寡聚化域样受体(NOD-like receptors,NLRs)识别出相关分子并对其模式进行鉴别[13],当识别出损伤及病原体模式时可以直接促进构建炎症小体,同时激活核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB),这些相关因子包括NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3)、IL-18前体(pro-IL-18)及IL-1β前体(pro-IL-1β)等。这一类炎症小体包括NLRs与黑色素瘤样受体,其中分布较多的为NLR家族,包括NLRP3和核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白4(NOD-like receptor family,pyrin domain-containing protein 4,NLRC4)等,最常见的为NLRP3[14]。这些蛋白分子可活化caspase-1、NLRs和包含亮氨酸的C末端,并产生更复杂的序列结构域,比如中央核苷酸结合寡聚结构域(nucleotide oligomerization domain,NOD)。NOD将NLRP3与凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis associated speck like protein containing a CARD,ASC)结合,ASC穿过caspase家族有关的募集域与caspase-1前体(pro-caspase-1)结合,因而产生了NLRP3炎症小体。将具有活性的caspase-1从pro-caspase-1中分离出来,同时活化IL-1β以及IL-18。与此同时,GSDMD也被切割成了2个部分[15],能迁移到质膜上的是比较有活性的GSDMD-N,它能将质膜裂解并使其产生距离为10～15nm的小孔隙,由于这种孔隙大大降低了细胞膜内外的离子梯度,水分子弥散内流及胞内钾离子外流,细胞内部的渗透力逐渐增加,细胞开始膨胀,质膜逐渐溶解,炎症级联反应发生,导致细胞焦亡。

1.3.2 非经典细胞焦亡途径分子机制 在该途径中,由动物基因组中的caspase-11和人基因组中的caspase-4/5,鉴别出LPS并与之反应产生毒性,然后,GSDMD再被caspase-4/5/11进行裂解,产生细胞焦亡;同时,活化的氨基末端GSDMD-N激活NLRP3炎性体。在病原体影响下,通过配体(如LPS)结合将髓样分化蛋白88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)衔接蛋白募集到IL-受体I(interleukin-1 type Ⅰ receptor,IL-1RⅠ)和IL-18受体(interleukin-18R,IL-18R)细胞质区域内的Toll样受体结构域,导致IL-1R相关激酶(interleukin receptor associated kinase,IRAK)的募集、激活和自磷酸化。然后IRAK从受体-MyD88复合物中释放出来,并与E3泛素连接酶肿瘤坏死因子受体相关因子(TNF receptor associated factor 6,TRAF6)偶联,后者自身泛素化并活化转化生长因子(transforming growth factor-β,TGF-β)激活激酶1(transforming growth factor-β-activated kinase 1,TAK1)[16]。与此同时TAK1激活IκB激酶复合物,并在IκBα介导的反应机制中产生NF-κB,其次激活NLRP3炎症小体,引发细胞焦亡。在此途径中,人体内的caspase-4/5与小鼠体内的caspase-1/11功能类似。

此外,Jiang等[17]发现,caspase-3可针对GSDME进行切割产生N末端片段,同时在质膜上形成孔隙,引发细胞焦亡。Zhou等[18]研究表明,活性氧能够与铁离子进行反应,活化铁离子并募集线粒体中的B淋巴细胞瘤-2因子(B-cell lymphoma-2,Bcl-2),导致细胞胞浆中的细胞色素(cytochrome,Cytc)增加并活化caspase-3,活性程度高的caspase-3切割高表达的GSDME引发细胞焦亡。此外,caspase-8可切割GSDMD引发细胞焦亡[19]。

2 细胞焦亡与脑出血

炎症反应在ICH机制中担负着重要角色,ICH时,炎症小体被活化,促进炎症因子释放,加重炎症反应,并由GSDMD介导细胞焦亡,导致ICH加重。在ICH发病时期,caspase-1、IL-1β和IL-18的mRNA及相关蛋白质在神经胶质细胞内的表达显著增加。神经胶质细胞在caspase-1所引导的经典途径被激活,发生细胞焦亡,IL-18及IL-1β这类炎症因子从细胞外基质内释放,加重ICH并产生继发性损害[20]。

Chen等[21]发现通过降低ICH后神经元NLRP3依赖的细胞焦亡途径,可以改善ICH后神经功能。目前临床上广泛应用的依达拉奉也是通过抑制小胶质细胞NLRP3的表达,在ICH后发挥神经保护作用,提示细胞焦亡的水平与ICH后的神经功能呈负相关。Li等[22]发现异甘草苷可以通过NF-κB信号通路抑制细胞焦亡,从而改善抑郁症。最新研究指出,植入具有持续硫化氢输送的丝素蛋白水凝胶可减少神经元焦亡,并促进严重ICH后的功能恢复[23]。以上表明,细胞焦亡与ICH的预后相关,而其对细胞焦亡的抑制将可能成为治疗ICH的新方案。现对细胞焦亡激活途径中囊括的核因子κB、caspase-1、GSDMD、NLRP3等分子因素在ICH中的作用机制展开探讨。

2.1 NF-κB与脑出血

NF-κB作为NF-κB蛋白家族的一种,一般在细胞质中是无活性状态。当细胞与外界因子反应后,NF-κB可以进入细胞核内,并结合相应的靶序列,从而调整相关基因的转录活性。有研究表明,ICH 4h内机体会释放大量的IL-17以激活NF-κB p65,核因子κB能够促进T细胞的活化,从而刺激成纤维细胞、内皮细胞等分泌IL-18、IL-16等炎症因子,最终促成炎症反应的发生与发展,从而进一步加重脑组织损伤。ICH后复杂的细胞因子网络激活NF-κB途径[24],而NF-κB作为转录中重要的调控因素,可影响黏附分子物质、即早基因组、细胞表面受体等细胞因子的表达。因此,NF-κB牵动着损害血管内皮细胞的相关机制,对于凋亡和炎症的调节都发挥着重要作用。Zhao等[25]研究显示,ICH血肿患者NF-κB表达明显增加,而控制NF-κB表达有利于抑制ICH炎症反应,减少脑细胞焦亡及降低血管损伤。综上可知,NF-κB参与ICH并在脑细胞焦亡发挥了关键作用。

2.2 caspase-1与ICH

Liang等[26]使用caspase-1抑制剂作用于ICH大鼠,结果发现大鼠脑血肿周围的IL-1β、IL-18含量减少,这表明caspase-1可加剧ICH的炎症反应,加剧继发性脑损伤。caspase家族共同负责细胞的程序性死亡,目前负责执行细胞凋亡命令的是caspase-3/6/7/8/9/10,控制细胞焦亡的caspase-1/4/5/11。细胞胞浆中的caspase-1前体可被炎症小体活化之后形成caspase-1四聚体。caspase-1参与细胞焦亡之后既能将IL-1β与IL-18前体切割为有活性的IL-18与IL-1β,促进1L-1β、1L-18的成熟;又可切割GSDMD,切割后的GSDND-N和细胞膜磷脂蛋白结合使细胞膜生成孔隙,IL-1β、IL-18与其他促炎因子经由孔隙移动至胞外引起炎症反应,从而诱导细胞焦亡。在NLRC4诱导的大鼠ICH炎症中,抑制caspase-1活化能减轻脑组织细胞损伤及抑制细胞焦亡,可减轻大鼠的神经损害[27]。

2.3 GSDMD与ICH

近年来的科学研究证实,焦孔素家族(Gasdermins,GSDMs)中含有GSDMA、GSDMB、GSDMC、GSDMD、GSDME以及PJVK(Pejvakin,亦称DFNB59)共6个蛋白,而对于GSDMD蛋白的研究国内外呈上升趋势[28]。GSDMD由GSDMD-NT和GSDMD-CT及相关结构域链接物构成,GSDMD-CT和GSDMD-NT反应之后互相对抗,正是这种特殊的双结构域使GSDMD具有自抑制作用。这种自抑制作用经由caspase-1/4/5/11活化裂解末端引发焦亡。Kayagaki等[29]研究表明,过量的GSDMD-NT活化反应能提高和加快细胞焦亡。GSDMD是细胞焦亡的关键蛋白,可通过不同途径刺穿细胞膜介导细胞焦亡,产生炎症反应,加快脑出血的进程并加重脑损伤。细胞焦亡反应中,GSDMD可作为关键因子来防治脑出血。

2.4 NLRP3与ICH

大量研究表明,在ICH诱导的继发性脑损伤中,先天免疫与炎症反应参与其中。细胞中的点样受体最近被证明发挥了关键作用,其中NLRP3最具代表性,它可以利用NLR识别一系列刺激,并产生凋亡相关斑点样蛋白以活化caspase-1。活化的caspase-1裂解为GSDMD、pro-IL-1β和pro-IL-18,并引起细胞焦亡及IL-1β和IL-18释放[30]。ICH后继发性损伤由原发损伤引发的级联效应(如机械破坏和质量效应)、凝血成分(如血红蛋白和铁)的释放以及对血肿的生物生理反应(如炎症)引起。随着常驻小胶质细胞的活化、大量白细胞及炎症因子的形成等,会产生炎症级联反应。NLRP3炎症小体可以介导血肿周围神经元死亡,尤其是在ICH整个过程中对炎症反应和免疫反应具有促进作用,NLRP3是该级联反应众所周知的组成部分[30]。NLRP3炎症小体与ICH诱导的继发性损伤有关,抑制NLRP3可能影响ICH细胞焦亡后的脑功能。

3 小 结

综上,细胞焦亡作为一种新型促炎程序性细胞死亡形式,在GSDM蛋白家族的裂解活性基础上和caspase家族产生炎症级联反应,参与ICH的发生发展。研究证实,ICH后NF-κB、caspase-1、NLRP3及GSDMD蛋白的基因表达极高,因此,对引起细胞焦亡的相关效应物NF-κB、caspase-1、NLRP3及GSDMD蛋白进行调控是治疗ICH的新策略。其次,细胞焦亡在ICH研究中的作用被初步关注,相关信号通路需要深入探索,为治疗ICH提供新方向。再次,由于目前关于细胞焦亡的靶向药物并未广泛应用于临床,因此还需要大量的临床试验来验证。最后,关于细胞焦亡非典型激活途径或其他特殊途径与ICH的关联需要进一步深入研究。