FADD基因在头颈鳞状细胞癌的预后价值

王晓忠 李 娜 王芊蔚 黄瑞哲 张月娇

Fas 通过死亡域关联（fas-associating with death domain protein，FADD）在细胞凋亡信号通路中扮演关键角色，是由肿瘤坏死因子受体超家族介导的。FADD 与Fas分子胞质区死亡结构域结合，可促进凋亡信号的传递，形成死亡诱导复合物，最终导致细胞凋亡。FADD 基因在肺癌、肝细胞癌、乳腺癌的进展存在密切联系，过度表达可导致肿瘤的进展及预后不良。肿瘤中FADD 的作用主要表现为促进肿瘤细胞的增殖和侵袭，过度表达可增强肿瘤细胞的凋亡抵抗性，从而促进肿瘤的进展和转移，因此，FADD已成为肿瘤治疗的重要靶点之一。深入研究FADD的分子机制，有助于揭示肿瘤发生的机制，为肿瘤的治疗提供新的思路和方法[1～7]。根据目前的报道，FADD 基因在程序性死亡过程中扮演关键角色，它通过调控半胱氨酸酶8 和苏氨酸蛋白激酶1 基因的表达水平[8～10]，激活NF-κB，促进促炎细胞因子和趋化因子的释放，从而促进肿瘤炎症浸润和进展。FADD 基因的Ser194 位点磷酸化降低与化疗耐药性和肿瘤转移密切相关，并且还能形成炎症小体。目前对FADD 基因在泛癌研究方面的了解仍然很有限[11，12]，此外，FADD 基因在肿瘤免疫细胞中的作用也还不清楚。本研究利用头颈鳞状细胞癌的数据对FADD 基因进行了综合分析，以明确该基因在头颈鳞状细胞癌中的预后影响。

资料与方法

1. FADD基因在人类泛癌组织中的表达水平

下载来自于GTEx 数据库和TCGA 数据库的表达谱数据，其来源于33 种不同类型的癌症和癌旁正常组织的原始数据，包括肾上腺皮质癌(ACC)、膀胱尿路上皮癌(BLCA)、乳腺癌(BRCA)，宫颈鳞癌和腺癌(CESC)、胆管癌(CHOL)、结肠癌(COAD)、弥漫性大B 细胞淋巴瘤(DLBC)、食管癌(ESCA)、多形成性胶质细胞瘤(GBM)、脑低级别胶质瘤(LGG)、头颈鳞状细胞癌(HNSCC)、肾透明细胞癌(KIRC)、肾乳头状细胞癌(KIRP)、急性髓细胞样白血病(LAML)、肝细胞肝癌(LIHC)、肺腺癌(LUAD)、肺鳞癌(LUSC)、间皮瘤(MESO)、卵巢浆液性囊腺癌(OV)、胰腺腺癌(PAAD)、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤(PCPG)、前列腺癌(PRAD)、直肠腺癌(READ)、肉瘤(SARC)、皮肤黑素瘤(SKCM)、胃癌(STAD)、甲状腺癌(THCA)、胸腺癌(THYM)、子宫内膜癌(UCEC)、子宫肉瘤(UCS)和葡萄膜黑色素瘤(UVM)。所有表达谱文件均为通过log2 转换进行标准化，提取头颈鳞状细胞癌(HNSCC)组织中FADD 基因表达水平。

2. FADD基因的预后分析

应用R语言“survminer”进行生存分析，FADD基因在头颈鳞状细胞癌中的预后指标进行相关分析，应用单因素生存分析计算风险比及95%置信区间，根据FADD 基因的高、低分组绘制Kaplan-Meier 曲线，评价FADD 基因的高、低分组对生存差异(OS、DSS、PFS)的影响。

3. 肿瘤突变负荷与微卫星不稳定性相关性分析

UCSC Xena(http://xena.ucsc.Edu/)下载TCGA 数据库中33 种癌症类型的突变数据，利用Perl 脚本根据肿瘤突变负荷定义计算每个样品的肿瘤突变负荷（TMB）。应用斯皮尔曼相关分析计算头颈鳞状细胞癌中肿瘤突变负荷、微卫星不稳定性与FADD 基因表达相关性。结果以R语言中“fmsb”包绘制雷达图（***P＜0.001;**P＜0.01;*P＜0.05）。

4. FADD基因和肿瘤免疫浸润的相关性分析

下载来源于TCGA数据库的33种癌症与癌旁正常组织的表达谱数据集，应用“Immuneeconv”R 包，集成TIMER 和xCell 两种算法，对FADD 表达谱文件和FADD 在头颈鳞状细胞癌（HNSCC）中的免疫浸润进行评估，FADD 基因表达水平以log2 TPM 值展示。采对FADD 基因和免疫检查点进行斯皮尔曼相关分析。应用R 语言“heatmap”R 包绘制热图。随后应用TIMER 数据库（https://cistrome. shinyapps. io/timer/），对HNSCC行肿瘤免疫浸润评估及分析。

5. 多因素COX回归分析

使用TCGA portal 分析FADD 基因对头颈鳞状细胞癌（HNSCC）的FADD 基因、年龄、性别、种族、临床分期、肿瘤纯度，总生存期等临床数据，进行多因素COX 回归分析，分析HNSCC 中FADD 基因表达水平与临床参数的关系。

6. 免疫组化验证

2021 年1 月至2022 年12 月，经陕西省咸阳市中心医院伦理委员会批准，患者自愿签署知情同意书。采用随机数字表法收集头颈鳞状细胞癌患者30 例。总共60 个样本包括癌和癌旁健康组织。术后病理检查主要记录肿瘤大小、分化程度、TMN 分期、FADD 免疫组化数据，从术后出院开始随访，时间为4～6个月。

主要试剂：不同浓度梯度的乙醇、PBS 缓冲液、3%过氧化氢、10%正常山羊血清、0.01 M 柠檬酸缓冲液、二甲苯，抗体由马克西姆生物科技有限公司提供，产地为中国福州。DAB 显色液（目录号AR 1022）购自中国武汉博斯特生物科技有限公司。FADD 抗体（1：500；目录号CY7126)，购自上海泊湾生物技术有限公司。酶标亲和纯化山羊抗兔IgG(1:20 00；目录号sa00001-2)，购自中国武汉博斯特生物科技有限公司。

主要实验步骤：①石蜡切片，脱蜡至水。②抗原修复。用柠檬酸缓冲液修复高压抗原，空气注入高压锅2 分钟，冷却至室温。③3%H2O2室温孵育10分钟，阻断内源性过氧化物酶活性。④5%BSA 室温孵育30 分钟，阻断非特异性抗原反应。⑤加入一抗工作液稀释一抗，稀释倍数为1:500，1%BSA。4℃孵育过夜，然后用PBS 缓冲液洗3 次，每次3 分钟。⑥每节加2 滴稀释比1:2000,1%牛血清白蛋白稀释室温孵育30 分钟。PBS 冲洗3 次，每次3 分钟。⑦DAB 显色，苏木精复染，并用中性树脂密封。

7. 统计学处理

使用SPSS22.0 软件和Rx64 3.6 软件，头颈鳞状细胞癌(HNSCC)的癌组织与癌旁正常组织之间的FADD 基因差异表达采用t检验Kaplan-Meier 生存分析采用Log-rank 检验法，对于头颈鳞状细胞癌的生存分析评价，使用Cox 比例风险模型计算HR 和p值，以P＜0.05 为差异有统计学意义。临床病理相关分析采用logistic 回归分析，生存分析应用Kaplan Meier 检验。FADD 在显微镜下观察实验结果，并在相同条件下拍照进行后续分析。FADD 阳性信号位于细胞质和细胞核上，苏木精染色后，治疗组呈棕黄色，呈强阳性信号。阳性细胞数＜10%为阴性，阳性细胞数＞10%为阳性，P值＜0.05有统计学意义。

结果

1. FADD基因在33种癌症中的差异表达分析

在TCGA portal 数据库（www.tcgaportal.org)中，FADD 基因在肿瘤组织中表达水平显著高于癌旁正常组织（P＜0.05，图1、图2）。FADD 基因在18 种恶性肿瘤中过度表达（图2）；FADD 基因在BLCA、BRCA、CHOL、COAD、ESCA、HNSCC-HPVpos、HNSCC、KICH、KIRC、KIRP、LIHC、LUAD、LUSC、PRAD、READ、SKCM、STAD、THCA、UCEC 癌症谱中异常高表达，其中FADD 基因在头颈鳞状细胞癌中最显著：HNSCC（P=3.05E-23）。

图1 FADD基因在33种癌症中的表达水平

图2 FADD基因在33种癌组织中与癌旁正常组织的差异表达***P＜0.001;**P＜0.01; *P＜0.05

2. FADD 基因对头颈鳞状细胞癌的OS、DSS、PFS三项预后指标的影响

在头颈鳞状细胞癌中，对FADD 基因表达水平和生存指标包括总生存率（overall survival，OS）、疾病特异性生存期（disease specific survival，DSS）、无进展生存期（progression-free survival，PFS）进行相关分析。结果显示，在总生存率方面，头颈鳞状细胞癌中FADD 基因高表达组的总生存率显著低于FADD 基因低表达组（P＜0.05，图3A）。此外，FADD基因对HNSCC（P＜0.05）的疾病特异性生存期有显著影响，即FADD 基因高表达组，相对于低表达组在头颈鳞状细胞癌中疾病特异性生存期较短（P＜0.05，图3B）。在无进展生存期方面，FADD 基因对HNSCC（P＜0.05）的无进展生存期有显著影响，既FADD 基因高表达组的无进展生存期显著低于FADD 基因低表达组（P＜0.05，图3C）。Cox回归模型分析表明，FADD 基因的高表达是包括HNSCC 在内的8种肿瘤类型患者OS 的危险因素（图4）。在头颈鳞状细胞癌中，FADD 基因的表达与OS（图4）、DSS（图5）、PFS（图6）显著相关。

图3 头颈鳞状细胞癌中，FADD基因高、低风险组对HNSCC的总生存率（P=0.005）、疾病特异性生存期（P=0.042）、无进展生存期（P=0.037）均有显著影响(P＜0.05)

图4 COX比例风险模型揭示FADD基因对HNSCC总生存率有显著影响(P＜0.001)

图5 COX比例风险模型揭示FADD基因对HNSCC疾病特异性生存期的差异影响(P＜0.01)

图6 COX比例风险模型揭示FADD基因对HNSCC无进展生存期的差异影响(P＜0.05)

COX 比例风险模型揭示，FADD 基因对HNSCC的总生存率有显著影响（P＜0.001，图4 所示）。FADD 基因对HNSCC（P=0.009）的疾病特异性生存期有显著影响（P＜0.01，图5 所示）。FADD 基因对HNSCC 的无进展生存期有显著影响（P＜0.05，图6所示）。

3. FADD 基因突变与肿瘤突变负荷、微卫星不稳定性的相关性分析

利用UCSC Xena 数据库（https://xena.ucsc.edu/）下载TCGA 数据库中33 种肿瘤类型的突变数据，进一步分析FADD 基因突变与肿瘤微卫星不稳定性的相关性，结果表明包括头颈部鳞状细胞癌在内的10种肿瘤的微卫星不稳定型与FADD 基因突变存在显著相关性。头颈部鳞状细胞癌的微卫星不稳定型与FADD 基因突变呈明显相关（P＜0.05），与FADD 基因突变呈正相关，其余肿瘤则与FADD 基因突变呈负相关（图7A）。再对FADD 基因突变与泛癌的肿瘤突变负荷进行相关分析，结果显示FADD 基因突变对头颈部鳞状细胞癌的肿瘤突变负荷无显著影响（P＞0.05，图7B）。

图7 FADD基因突变与肿瘤突变负荷、微卫星不稳定性的相关性分析

4. FADD 基因与头颈部鳞状细胞癌的免疫浸润分析

将FADD 基因表达谱数据与免疫增强剂之间进行斯皮尔曼相关性分析，结果显示头颈部鳞状细胞癌中FADD 基因的表达水平与CD276 的表达水平成正相关，而与CD27浸润水平呈负相关（图8A），具体而言，与TGFB1（R=0.341）、CD276（R=0.42）的表达水平呈正相关。FADD 的表达水平与CD27（R=-0.215）的表达水平呈负相关（图8B），从而说明FADD 在调节免疫细胞浸润和免疫增强剂的功能中发挥重要作用。

图8 FADD基因在泛癌的免疫浸润

5. 多因素COX回归分析

研究纳入下列指标：FADD 基因、年龄、性别、种族、临床分期、肿瘤纯度，应用多因素Cox分析，研究发现在头颈鳞状细胞癌中，FADD 基因、年龄和肿瘤分期（stageⅣ）都被确定为危险因素，即与较短的总生存期相关（P＜0.05）。这意味着FADD 基因的差异表达量、年龄较大以及肿瘤处于较晚期（stageⅣ）都会对头颈鳞状细胞癌患者的预后产生不良影响。

6. FADD 基因在头颈部鳞状细胞癌中免疫细胞浸润分析

研究发现头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）与FADD基因的差异表达之间存在密切相关。此外，通过分析肿瘤微卫星不稳定性和肿瘤突变负荷等指标，也发现了HNSCC 与FADD 基因的密切相关性。进一步应用TIMER 数据库对HNSCC 中FADD 基因表达水平，与免疫浸润细胞之间的关系进行分析，发现特定的免疫细胞亚型与HNSCC 密切相关（图9A-C）。具体而言，FADD 基因的表达与静息CD4 T 细胞、M0巨噬细胞、中性粒细胞浸润、树突状细胞呈正相关（图9D），而与CD8 T 细胞、B 细胞呈负相关（图9D）。HNSCC 这些结果表明FADD 基因在HNSCC 的发生和免疫浸润中可能发挥重要的作用。

图9 HNSCC免疫细胞浸润状况及FADD基因与细胞亚型的相关分析

7. 免疫组织化学验证

研究结果显示，FADD 基因染色呈阳性，棕黄色颗粒位于细胞核、细胞质。相比于阴性对照组(0.1 mol/L PBS)，阳性表达率在肿瘤细胞中明显高于正常的颊黏膜(图10)，此外，FADD 基因的高表达与HNSCC组织以及预后较差相关。

图10 FADD在正常口腔组织、颊黏膜中分化鳞状细胞癌、舌根鳞状细胞癌的差异表达

表1 纳入HNSCC的临床参数指标、FADD基因表达量进行多元回归分析

讨论

FADD 基因作为肿瘤坏死因子受体超家族介导的传递凋亡信号，是细胞坏死的负调控关键基因，其作为死亡受体和启动caspase-8/caspase-10 之间的桥梁，可以介导与死亡受体和caspases 的相互作用，诱导细胞凋亡[12]。有研究使用了Lasso Cox 回归分析模型来构建头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）中自噬相关基因（ARGs）的预测模型[13]。研究发现FADD的免疫组化过表达与HNSCC 患者的总生存期风险比增加密切相关[14]。然而，该研究缺乏免疫组织化学评估，研究建议在HNSCC 的预后评估中应考虑应用FADD 过表达的免疫组织化学评估。此外，通过比较来自GEO 数据集的HPV 阳性和HPV 阴性HNSCC患者的转录组数据，研究确定了与HPV相关的标志物。研究选了7 个与HPV 阳性相关的标志物，包括CDKN2A，CELSR3，DMRTA2，SERPINE1，TJP3，FADD 和IGF2BP2[15]。这些标志物可能有助于预测HPV 阳性HNSCC 患者的预后。在已经发表的研究中，在HNSCC 研究中，FADD 构建的联合模型的预后价值已经被研究，但其单个基因在HNSCC 预后评估中的研究仍未展开。本研究通过应用GTEx数据库和TCGA 数据库中HNSCC 的表达谱文件，研究FADD 基因在该癌症中的预后价值。结果表明，FADD 基因可作为一种用于预测HNSCC 患者预后的标志物，并与肿瘤免疫浸润细胞的类型相关联。FADD 基因是HNSCC 中一种被研究广泛的基因，不仅在HNSCC 的发生过程中起到重要的作用，而且在该癌症的预后中也具有重要意义。本项研究证明，FADD 基因在HNSCC 的预后中具有非常显著的价值，其基因表达水平能够预测HNSCC患者的预后。

微卫星不稳定性（microsatellite instability, MSI)是一种基因组异常，常见于各种癌症。FADD 蛋白参与细胞对外部应激信号的反应，激活程序性细胞死亡途径。目前的研究表明，FADD 基因的突变与淋巴瘤、乳腺癌和结肠癌等多种癌症相关[16～19]，而且目前发现FADD 基因突变可能与结直肠癌的MSI 相关。在结直肠癌中，与微卫星稳定（MSS）结直肠癌相比，MSI 结直肠癌中FADD 基因的表达水平较低[20]，这一观察结果暗示FADD 可能在调节癌细胞微卫星稳定性中发挥作用。进一步的研究表明，FADD 与错配修复系统（MMR）之间存在功能关系。MMR 是一种DNA 修复机制，对维持微卫星的稳定性起着重要作用。一些研究报道表明，FADD 通过促进MMR 向细胞核的募集参与了MMR 功能的调节。FADD 基因的敲除导致MMR 蛋白的表达减少，从而导致MSI。除了结直肠癌，MSI 和FADD 突变也与乳腺癌、胃癌和淋巴瘤有关[21]。总之，微卫星不稳定性（MSI）与FADD 基因的突变和表达水平低有关，FADD 基因可能通过调节微卫星稳定性参与癌细胞的形成。FADD 基因与头颈癌MSI 的关系尚未被充分研究，需要进一步的研究来确定它们之间的关联。

有研究提示FADD 可能参与了口腔癌的免疫调节，与自噬有关[22]。FADD 是死亡受体介导细胞凋亡的关键受体蛋白，与先天免疫、炎症和癌症的发生有关[23]。有研究应用基因集富集分析显示，FADD相关基因显著富集于免疫相关通路。相关性分析显示FADD 的上调与口腔癌的低生存率和免疫浸润相关[22]。相对于CD276 基因低表达，CD276 基因高表达已被证实癌症患者的预后不良，CD276 在肿瘤中参与调控细胞增殖、凋亡、侵袭、细胞周期、细胞分化、细胞自噬、充质转化。瓦伯格效应（Warburg Effect）也是由CD276促进的。本研究观察CD276在HNSCC 肿瘤高表达，FADD 表达量的增加与CD276呈正相关，也发现FADD 表达增加与CD27 呈负相关，而CD27通过局部共刺激在T 细胞活化中起关键作用信号，被认为是肿瘤治疗中的免疫调节关键靶点[24]。一些研究表明，FADD 基因可能通过调节肿瘤相关免疫细胞的功能来影响HNSCC 预后。本研究中，笔者发现FADD 基因水平与HNSCC 中肿瘤免疫浸润细胞静息CD4 T 细胞、M0 巨噬细胞、中性粒细胞浸润、树突状细胞呈正相关，而与CD8 T细胞、B细胞呈负相关。这一结果表明FADD 基因在调节肿瘤免疫系统中具有重要的作用，从而影响HNSCC 患者的预后。总之，FADD 基因在HNSCC 的预后中具有显著价值，该研究为HNSCC 患者的治疗提供了新思路，也为患者的预后评估提供了新的方法。