牙龈卟啉单胞菌外膜囊泡对牙周炎影响的研究进展

邓 愉 曹牛奔 刘笑梦 于维先

牙周炎是一种慢性炎症性疾病，表现为结缔组织破坏，牙槽骨吸收，最终导致牙齿脱落。革兰氏阴性菌—牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis）是牙周炎的主要病原菌[1]。

研究发现，大多数革兰氏阴性菌在生长过程中能够通过外膜的囊泡化产生一种直径约50～250 nm的球形双层膜状结构，称为外膜囊泡（outer membrane vesicles, OMVs）。OMVs 主要含有磷脂、脂多糖、外膜和周浆间隙的蛋白质、核酸、酶和毒力因子等，在生物分子的传递、细胞间相互作用、生物膜形成及免疫调节等方面发挥重要作用[2，3]。更重要的是，OMVs 似乎比亲本细菌更具有优势性。例如，OMVs 可以免受蛋白水解酶降解，在远端器官或组织中传播[4]。

20 世纪80 年代，Williams 首次报道P.gingivalis能够产生OMVs[5]。OMVs携带大量亲本细菌的毒力因子，拥有P.gingivalis的基本生物学特性，如诱导炎症反应、损害宿主细胞和将毒力因子传递到宿主细胞[6]，在牙周炎的发生发展中起到重要作用。本文综述了牙龈卟啉单胞菌外膜囊泡（Porphyromonas gingivalisouter membrane vesicles,P. gingivalisOMVs）的产生、毒力作用及其对牙周炎的影响，旨在为牙周炎的预防和治疗提供新思路。

一、P.gingivalis OMVs的形成机制及影响因素

1.形成机制

OMVs 是由细菌外膜包裹周质内容物、肽聚糖片段和核酸通过出芽的方式形成[7]。OMVs 的形成机制目前尚未完全阐明。当前已建立的假说试图从分子水平解释OMVs 的形成机制：①细菌外膜和肽聚糖之间共价键的丢失或重新定位，以及细菌外膜的生长速度较细胞壁快，使得细菌外膜突出，从而引发囊泡形成[8]；②肽聚糖片段或错误折叠蛋白质的累积对细菌外膜施加膨胀压力，导致外膜膨胀，最终收缩形成囊泡[9]；③磷脂、脂多糖和其他特定分子富集在细菌外膜上，使得细菌外膜的曲率发生变化从而产生OMVs[10]；④Roier 等人提出了一种可由磷脂转运体VacJ/Yrb ABC 调节OMVs 产生的机制。首先VacJ/Yrb基因表达的减少或缺失导致磷脂在细菌外膜中积聚，这种不对称膨胀会触发细菌外膜向外膨胀；其次细菌外膜上的正曲率和负曲率将导致磷脂进一步富集，并支持细菌外膜出芽，最终释放形成OMVs[11]。上述机制可能都参与了P.gingivalisOMVs的形成，但P.gingivalis在不同的环境条件下或在不同的生长阶段产生OMVs 的机制是否一致还有待研究。

2.影响因素

OMVs 是细菌对各种外部应激的反应产物，其包含的物质是动态的，可根据不同的生长条件进行调整[12]。首先，OMVs的形成受基因调控。P.gingivalis菌株根据菌毛主要亚单位FimA 的基因型分为六种类型（Ⅰ型和Ib-V 型）。Ⅰ型（ATCC 33277）和Ⅲ型（ATCC 49417）菌株分泌的OMVs 要比Ⅳ型（W83）菌株的多。当Ⅳ型FimA 基因被插入Ⅰ型菌株时，FimA 亲本菌株和受体菌株形成的OMVs 数量相似，这表明菌毛亚型参与了P.gingivalisOMVs 的形成[13]。编码牙龈蛋白酶的rgpA 基因的缺失也会导致OMVs 的生成减少[14]。其次，OMVs 的生成数量及内容物还会随着环境的变化而变化，尤其在应激条件下，例如PH值和温度的变化、低浓度血红素、噬菌体感染以及与宿主细胞和其它细菌的相互作用等，都会增加OMVs的生成和释放[12，15]。

二、P.gingivalis OMVs的成分及作用

OMVs 为球形纳米蛋白脂质体，具有体积小且结构稳定的特点，能更好的进入深层组织，激活宿主炎症反应[15，16]。OMVs中的脂多糖、蛋白质等毒力因子以及遗传物质等在促进疾病发展、调节菌斑生物膜以及使细菌发生免疫逃逸中发挥重要作用[17～19]。

1.脂多糖

脂多糖是革兰氏阴性菌的基本结构，是革兰氏阴性菌表面最丰富的抗原[20]。脂多糖由脂质A、多糖核心和一条称为O 抗原的多糖长链组成[16]。P.gingivalisOMVs中富含大量脂多糖，与OMVs 的形成及蛋白质内容物的组成有关[9]。P.gingivalis表达两种类型的脂多糖，带中性电荷的脂多糖和带负电荷的脂多糖，其中带负电荷的脂多糖的O 抗原链有助于OMVs 的形成[21]。另外，根据多糖的组成或长度，脂多糖可选择性的将外膜蛋白组装到OMVs 中，这一机制促进牙龈蛋白酶优先组装到OMVs 中[22]。牙龈蛋白酶可导致不同类型的细胞死亡，包括内皮细胞、人牙龈成纤维细胞、人牙龈上皮细胞以及成骨细胞[23]，在牙周炎的发生发展过程中起到重要作用。

2.蛋白质

蛋白质组学分析结果显示OMVs 与亲本细菌外膜具有相似的蛋白质图谱[24]，但OMVs 中的蛋白质组成和特定蛋白质的相对丰度与亲本细菌表面不同[25]。通过比较OMVs 和细菌外膜中外膜蛋白的相对丰度，发现具有C 末端结构域的蛋白和一些脂蛋白优先被分选到OMVs，而Ton-B依赖性转运蛋白和具有外膜蛋白A样蛋白肽聚糖结合基序的蛋白质优先保留在细菌外膜[26]。富集C 末端结构域的蛋白质能够与带负电荷的脂多糖连接促进电子致密表面层的形成，为OMVs 提供光滑的表面，研究发现，具有光滑表面的OMVs 在与宿主细胞膜相互作用时能够保持其球形结构，而粗糙型OMVs 结构会发生扭曲。OMVs的结构又会影响OMVs的内化：球形纳米颗粒倾向于被宿主细胞膜完全包裹，而结构发生扭曲的纳米颗粒倾向于留在细胞表面[21，27]。牙龈蛋白酶是OMVs 中的主要致病蛋白，具有蛋白水解活性，可以直接和（或）间接破坏牙周组织，已被认为是重要的毒力因子[28]。有研究表明，具有C 末端结构域的牙龈蛋白酶在OMVs 中表现出中高比率，且含量是亲本细菌的三到五倍[29]，在细菌聚集及生物膜形成方面发挥重要作用[20]。

OMVs 中其它富集C 末端结构域的蛋白质也被认为与毒力有关，例如：CPG70 羧肽酶、肽基精氨酸脱亚氨酶及血凝素等[26，30]。其中肽基精氨酸脱亚氨酶能被带负电荷的脂多糖修饰，在影响OMVs 的形成，促进生物膜形成和OMVs 的表面移位中发挥重要作用，是牙周炎的潜在致病因素[31]。当细菌在不同的环境条件下生长时，OMVs 的蛋白质组成及含量会发生变化，这暗示特定蛋白质有选择地进入OMVs，但具体机制还有待深入研究。

3.遗传物质

OMVs 还携带有亲本细菌的DNA 以及mRNA、sRNA 和其他非编码RNA。OMVs 的独特保护结构使得OMVs能够将细菌DNA和信号分子带到远端靶器官而不会被降解。研究发现，外膜囊泡中的mRNA 可以在进入宿主细胞后被转录和翻译[32，33]，sRNA 能够被包装至OMVs，调节宿主基因的表达，从而调节宿主免疫反应[34]。因此OMVs 可以在细胞间传递遗传信息。

三、P.gingivalis OMVs在牙周炎发生中的作用

P.gingivalis作为红色复合体菌群的核心成员与牙周炎的发生发展密切相关[35]。P.gingivalisOMVs能够发挥“哨兵”作用提前到达疾病部位，与宿主细胞和免疫细胞相互作用[7]。P.gingivalisOMVs 首先黏附定植于上皮细胞，损害上皮屏障并侵入皮下组织，进而激活免疫细胞及其它组织细胞，参与牙周炎症和组织破坏。

1.P.gingivalisOMVs对牙龈上皮细胞的作用

P.gingivalis的一个重要特征是它能够侵入宿主细胞并在其中存活。在P.gingivalisOMVs 中发现了几种与P.gingivalis黏附和侵袭宿主细胞有关的膜蛋白，包括FimA、血凝素A 和热应激蛋白[36]。因此，P.gingivalisOMVs 能侵入牙龈上皮细胞和牙龈成纤维细胞，且Ⅰ型菌株的OMVs比Ⅳ型菌株的OMVs侵袭力更强[37]。菌毛蛋白和牙龈蛋白酶还为OMVs提供了粘附和蛋白水解的能力，使P.gingivalisOMVs能够破坏粘膜上皮的完整性，其中牙龈蛋白酶可以特异性降解牙龈上皮细胞连接粘附分子,导致牙龈上皮对40 kDa右旋糖酐、脂多糖和蛋白聚糖的通透性增大[38]，造成牙龈上皮的进一步损伤。细胞迁移所需的信号分子转铁蛋白受体和整合素也能被OMVs降解，导致上皮细胞功能受损[39]。

2.P.gingivalisOMVs对免疫细胞的作用

P.gingivalisOMVs 在穿过宿主上皮细胞屏障进入粘膜下层后，能够直接与各种免疫细胞相互作用，包括中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞等，从而引起免疫反应失调和炎症。

中性粒细胞是先天免疫系统对抗微生物病原体的主要效应体，也是龈沟液中最丰富的细胞。中性粒细胞除了作为吞噬细胞，还可以释放其细胞外染色质、核蛋白和丝氨酸蛋白酶形成网状纤维结构，称为中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps, NETs）。P.gingivalisOMVs 中的牙龈蛋白酶在NETs 的形成中起着双重作用：牙龈蛋白酶是NETs 形成的有效直接诱导剂，但同时也可阻止NETs 对P.gingivalis的诱捕。这导致牙周袋中存在大量的中性粒细胞和NETs，但牙周病原体和相关的病原体也依然大量存在[40]。P.gingivalisOMVs 中富含的脂多糖也会影响中性粒细胞，包括细胞因子和NETs 的产生及细胞死亡。例如脂多糖能够促进炎症因子白细胞介素（interleukin, IL）-8 的分泌。IL-8 是一种诱导中性粒细胞募集的趋化因子[41]，这种招募可能会导致牙周组织长时间处于炎症状态。

P.gingivalisOMVs 能够刺激巨噬细胞产生肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α）、IL-6 和IL-10 等，还会引起巨噬细胞代谢的改变，从氧化磷酸化转变为糖酵解，这一转变使得线粒体耗氧量减少以及线粒体活性氧生成增加，使得OMVs 更能激活炎症信号和细胞焦亡[42]。体外研究发现，P.gingivalisOMVs 能够促进人U937 巨噬细胞样细胞表面脂多糖受体CD14的脱落和裂解，这导致巨噬细胞对脂多糖刺激的反应性降低，使P.gingivalis和其它牙周病原体逃避宿主免疫系统的能力增加[43]。OMVs 还可作用于树突状细胞，诱导树突状细胞成熟并参与免疫调节[44]。

3.P.gingivalisOMVs对血管内皮细胞的作用

在牙周炎的进展过程中往往伴随着新生血管的形成，以修复炎症所破坏的牙周组织。体外研究发现P.gingivalisOMVs 能够抑制人脐静脉内皮细胞增殖，通过激活细胞外信号调节激酶1/2（extracellular signal-regulated kinase 1 and 2, ERK1/2）和p38 丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase, p38 MAPK）抑制小鼠主动脉内皮细胞中一氧化氮合酶的表达，以剂量依赖性方式抑制毛细血管的形成[39，45，46]。P.gingivalisOMVs 中的牙龈蛋白酶能够降解血小板内皮细胞粘附分子-1 和血管内皮钙粘蛋白，破坏内皮细胞的连接，导致血管损伤和内皮通透性增加，导致内皮功能障碍[47]。P.gingivalisOMVs也被观察到能够影响内皮细胞的炎症反应。例如，在γ干扰素刺激的内皮细胞中加入P.gingivalisOMVs可抑制细胞表面Ⅱ类主要组织相容性复合物的上调，从而调节抗原呈递并有利于病原体的存活[43]。

4.P.gingivalisOMVs对其它组织细胞的作用

OMVs 已被证明是细菌和宿主组织之间通信的重要媒介。P.gingivalisOMVs 包含大量微生物相关分子模式能够与宿主模式识别受体结合，启动促炎级联反应，导致细胞因子、趋化因子和抗菌肽的产生[48]，其启动病原体识别和炎症信号的方式可能受到所包含的鞘磷脂亚型的限制[39]。在进入黏膜下层后，OMVs 中的牙龈蛋白酶既可通过引起细胞凋亡导致成骨细胞功能受损，又能促进破骨细胞前体细胞增殖，促进核因子-κB 受体激活因子配体诱导的成熟破骨细胞的分化并增强破骨细胞的功能[23，49]，使得骨吸收大于骨再生，最终导致牙齿脱落。

5.调节菌斑生物膜

牙菌斑是附着在牙齿表面的一种复杂生物膜，大约由700 多种细菌组成。在易感个体中，龈下菌斑生物膜中的细菌会促使微生物失调，导致牙齿支持组织逐渐破坏[50]。在菌斑生物膜中不同细菌之间的相互作用是通过粘附素与其受体之间的特异性识别而建立。P.gingivalisOMVs 中存在多种粘附素，如菌毛、牙龈蛋白酶和血凝素等。因此，P.gingivalisOMVs 可以与其他细菌相互作用，参与调节整个微生物群落[51]。P.gingivalisOMVs 介导了白色念珠菌和金黄色葡萄球菌的聚集。在没有OMVs 或热处理OMVs 的情况下白色念珠菌和金黄色葡萄球菌则不会发生聚集。因此，P.gingivalisOMVs 可能是这两种细菌之间的纽带[6]。此外，P.gingivalisOMVs 还可以增强福赛坦氏菌对上皮细胞的附着和侵袭[36]。而P.gingivalisOMVs中的蛋白酶能够降低具核梭杆菌表面粘附相关蛋白FadA 和FomA 的表达水平，抑制具核梭杆菌对口腔上皮细胞的侵袭及具核梭杆菌的自聚集[52]。P.gingivalisOMVs 可以保护其它细菌免受血清杀菌作用的影响，并通过OMVs 中的脂多糖与洗必泰结合，从而为P.gingivalis和其它口腔细菌提供保护[53]。

四、P.gingivalis OMVs应用研究前景展望

OMVs 最初被认为是细胞碎片，然而随着研究的不断深入，其在细胞间通讯、防御和宿主的免疫调节等过程中的重要作用已被逐步认知。近年来，OMVs 在疫苗开发以及药物载体等方面显示出了巨大的应用前景。OMVs 具有被免疫细胞摄取的最佳体积，并且具有结构和功能稳定性，表现为①OMVs在不同温度及条件下能够保持完整和稳定；②具有无生命活性、非复制性和佐剂作用，含有大量与亲本细菌相关的免疫原性成分[54]，能够引发先天性和适应性免疫反应[55]。有研究表明，P.gingivalisOMVs能够作为牙周炎疫苗的候选黏膜免疫原和佐剂[56]，并且已经取得了一些令人满意的结果。经鼻或经皮给予P.gingivalis的40-kDa 外膜蛋白可在血清和唾液中诱导特异性血清免疫球蛋白（immune globulin,Ig）G抗体，抑制P.gingivalis的共聚集活性，这意味着这种片段化的外膜蛋白对慢性牙周炎的疫苗接种是有用的[57]。继而，Nakao 等人又对小鼠进行鼻内免疫，评估P.gingivalisOMVs 作为疫苗抗原的能力。在接种P.gingivalisOMVs 后，鼻腔冲洗液和唾液中以OMVs 的剂量依赖性方式产生P.gingivalis特异性抗体IgA 以及血清中IgG 和IgA 水平显著升高，分别维持至少28 和18 天[58]。研究人员进一步指出，P.gingivalisOMVs 中的脂多糖和带负电荷脂多糖的修饰蛋白是导致小鼠体内产生P.gingivalis特异性抗体的决定因素[59]。除此之外，与合成载体相比，OMVs具有多种优点，如小颗粒尺寸、可靠的载药能力和优良的生物相容性[60]。因此，OMVs 有望成为一种潜在的药物传递系统。

然而，P.gingivalisOMVs 的应用仍然面临一些问题。首先，OMVs 的大规模标准化生产还存在一定的难度，达不到目前临床应用的标准；其次，OMVs具有一定毒性，能够对机体产生部分毒副作用，需要仔细衡量免疫效果和潜在副作用之间的平衡；第三，作为药物递送的载体，还需要更多的修改技术来提高其稳定性、靶向性和安全性[61，62]；最后，Gabarrini等人从P.gingivalis临床分离株中初步检测到肽基精氨酸脱亚氨酶，其中包含的两种蛋白成分与OMVs相同[63]，但目前关于P.gingivalis临床分离株OMVs的研究尚不充分。