药浴对仿刺参幼参肠道菌群的影响

李石磊,杨慧花,张 乾,王旭达,董 颖,叶 博,赵振军,王笑月,刘丹妮,曹 琛,周遵春

( 辽宁省海洋水产科学研究院,辽宁 大连 116023 )

仿刺参(Apostichopusjaponicus)养殖是我国海水养殖的特色支柱产业。20世纪80年代中期突破苗种规模化繁育技术,90年代初池塘养殖和海区增殖开始,目前仿刺参养殖区域遍布辽宁、山东、河北、福建等地沿海。仿刺参营底栖生活并以沉积物为食,肠道内的大量微生物发挥重要作用,肠道菌群与宿主仿刺参之间存在着相互影响、相辅相成的关系,肠道微生物在宿主提供的环境内存活生长,同时肠道微生物对仿刺参起到辅助消化、营养吸收、免疫刺激、致病拮抗等作用,因此对仿刺参肠道菌群多样性的研究十分重要[1-3]。目前对仿刺参肠道菌群的研究较多,包括仿刺参肠道菌群与养殖环境关系[4-5]、不同季节不同温度下仿刺参肠道菌群结构与功能特点[6-7]、不同地域仿刺参肠道菌群结构差异[8-10]、不同养殖时期不同个体规格的仿刺参肠道菌群分析[11-12]、外源物投入对仿刺参肠道菌群结构的影响[13-15]等研究。

浸泡(药浴)法是一种常见的水产动物疾病治疗方法。在鱼病防治中,针对寄生虫引起的各种疾病,采用药液浸泡法能获得良好的效果。由于仿刺参体表缺少坚硬外壳保护,在仿刺参保苗过程中的倒池操作容易造成仿刺参苗种体表机械损伤,为防止伤口出现细菌继发性感染,部分养殖从业人员通常会采用抗生素对仿刺参苗种进行药浴。为确定抗生素药浴对仿刺参苗种肠道菌群结构的影响,笔者对倒池时未药浴和经氟苯尼考药浴的仿刺参幼参肠道菌群结构进行比较分析,旨在为仿刺参保苗提供数据参考和技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用仿刺参幼参为当年5月中旬产卵繁育,培育地点在辽宁省海水养殖引育种中心。幼参投喂的饵料为40%马尾藻(Scagassumsp.)和60%海泥,隔天泼洒地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)和嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)各3～5 mL/m3,根据幼参状态和池底情况每15～20 d倒池1次,试验选用仿刺参幼参单体质量为(5.21±0.42) g。

1.2 药浴方法

倒池时将幼参收至塑料盆中,平均分为2组,设置普通组和药浴组。普通组直接将幼参泼洒至1#池,药浴组采用水产用氟苯尼考对幼参进行药浴,药浴质量浓度0.1 g/L,药浴15 min,药浴后将幼参泼洒至2#池。倒池后当日开始投喂饲料和益生菌,试验期间水温14～15 ℃,pH 8.0～8.2,盐度32。

1.3 样品采集

倒池前取幼参肠道样品标记为A,在倒池后24、48、72 h取普通组幼参样品标记为A1、A2、A3,取药浴组幼参样品标记为B1、B2、B3。每次2组各随机取10只幼参置于过滤海水中24 h,保证其肠道内含物排空,然后在无菌环境下用灭菌剪刀剪开幼参体腔,用0.9%的无菌生理盐水冲洗肠道外壁,将采集的幼参肠道混合置于无菌的研钵内研磨得到匀浆,用细菌DNA提取试剂盒完成基因组DNA抽提,利用1%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA。

1.4 细菌16S rDNA扩增和测序

Illumina PE250文库制备和高通量测序工作由上海凌恩生物科技有限公司完成。细菌16S rDNA 基因V4～V5区扩增引物为515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′)和907R(5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′)。

1.5 数据分析

利用Usearch(vsesion 10 http://drive5.com/uparse/)软件以97%相似性对非重复序列(不含单序列)进行运算分类单元聚类,在聚类过程中去除嵌合体,得到运算分类单元的代表序列。将所有优化序列比对至运算分类单元代表序列,选出与运算分类单元代表序列相似性在97%以上的序列,生成运算分类单元表格。采用RDP数据库贝叶斯分类法对运算分类单元代表序列进行分类学分析,并分别在各分类水平统计各样本的群落组成。利用MOTHUR软件做稀释性曲线分析,计算菌群丰富度(Chao指数)、香农指数、辛普森指数、测序深度指数。利用OriginPro 9.0软件制作多样本柱形图。

2 结 果

2.1 稀释性曲线

以97%相似性水平标准划分运算分类单元,基于随机选取一定数量的测序序列及其对应的运算分类单元种类得到的稀释性曲线,当曲线趋向平坦时,说明测序数据量合理,测序结果能够真实地反映样品中优势细菌的数量关系(图1)。

图1 稀释性曲线Fig.1 The dilution curve

2.2 菌群多样性分析

通过样品测序序列计算各样品中细菌多样性指数(表1)。各组样品数据有效序列数为29 767～40 038,文库覆盖率均逾99.8%,可分别划分为159、165、160、162、349、189、160个运算分类单元。倒池药浴后24 h幼参肠道样品组菌群丰富值最高,倒池药浴后48 h幼参肠道样品组其次,其余样品菌群丰富值比较接近。倒池药浴后24 h幼参肠道样品组香农指数最大,为3.3,辛普森指数最小,为0.1258。倒池药浴后48 h幼参肠道样品组和倒池药浴后72 h幼参肠道样品组香农指数分别为2.12和0.69,高于倒池前幼参肠道样品组和倒池未药浴的各幼参肠道样品组;辛普森指数分别为0.3817和0.7351,低于倒池前幼参肠道样品组和倒池未药浴的各幼参肠道样品组。倒池后24 h幼参肠道样品组细菌多样性最高,倒池药浴后48 h幼参肠道样品组和倒池药浴后72 h幼参肠道样品组次之,倒池前幼参肠道样品组和倒池未药浴的各幼参肠道样品组细菌多样性较低。

表1 细菌多样性指数

2.3 运算分类单元相似性分析

基于样品运算分类单元数制作韦恩图并进行相似性分析(图2)。倒池前幼参肠道样品组和倒池未药浴的各组幼参肠道样品的运算分类单元相似性高达99%,未列入图2中。倒池前幼参肠道样品组与倒池药浴后24 h幼参肠道样品组共有运算分类单元数91个,占二者总数的23.8%;倒池前幼参肠道样品组与倒池药浴后48 h幼参肠道样品组共有运算分类单元数71个,占二者总数的25.6%;倒池前幼参肠道样品组与倒池药浴后72 h幼参肠道样品组共有运算分类单元数98个,占二者总数的44.3%。随时间推移,倒池药浴后各幼参肠道样品组与倒池前幼参肠道样品组的相似性逐渐升高。

图2 样品运算分类单元的韦恩图Fig.2 The Venn diagram of operational taxonomic unit

2.4 基于门水平上的菌群结构分析

对全部样品的有效序列进行基于门水平上的菌群结构分析,得到各组样品的细菌门类及相对丰度(表2)。各组样品的优势菌均以变形菌门为主,相对丰度超过90%。倒池前幼参肠道样品组和各倒池未药浴幼参肠道样品组的变形菌门相对丰度超过98%,倒池药浴后24 h幼参肠道样品组的变形菌门相对丰度为90.51%、放线菌门为3.08%、浮霉菌门为2.12%、拟杆菌门为1.35%,倒池药浴后48 h幼参肠道样品组的变形菌门为92.99%、放线菌门为2.62%、拟杆菌门为1.75%,倒池药浴后72 h幼参肠道样品组的变形菌门为96.63%、放线菌门为1.14%、拟杆菌门为1%。相比于未药浴组,酸杆菌门、绿弯菌门、疣微菌门、厚壁菌门和蓝细菌相对丰度在药浴组均有所提高,但均不超1%。达达菌门、德潘菌门和芽单胞菌门均未在普通组样品检测到,为药浴组样品独有。

2.5 基于属水平上的菌群结构分析

基于属水平上的菌群结构分析结果显示,药浴组与普通组幼参的肠道菌群结构存在较大的差异(图3)。无论是倒池前还是倒池后,未药浴幼参肠道中新草螺菌属(Noviherbaspirillum)均占主要优势,相对丰度达95%。倒池药浴后24 h幼参肠道样品中新草螺菌属相对丰度降至2.46%,新的优势菌属叶杆菌属(Phyllobacterium)和CandidatusCompetibacter相对丰度分别为43.4%和16.9%,相对丰度1%以上的菌属包括:鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)(5.9%)、丛毛单胞菌属(Curvi-bacter)(3.6%)、Pelagibacterium(2.3%)、Rudaea(2.0%)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)(1.8%)、不动杆菌属(Acinetobacter)(1.4%)、Lutibacter(1.3%)、Defluviicoccus(1.2%);倒池药浴后48 h幼参肠道样品组中新草螺菌属相对丰度恢复至36.7%,叶杆菌属和CandidatusCompetibacter相对丰度分别为26.6%和11.8%,相对丰度1%以上的菌属包括:鞘氨醇单胞菌属(4.6%)、丛毛单胞菌属(1.65%)、Pelagibacterium(1.6%)、慢生根瘤菌属(1.17%)、Lutibacter(1.1%);倒池药浴后72 h幼参肠道样品组中新草螺菌属相对丰度恢复至69.9%,叶杆菌属和CandidatusCompetibacter相对丰度分别为10.5%和8.5%,相对丰度1%以上的菌属仅有鞘氨醇单胞菌属(3.7%)。

图3 属水平上幼参肠道菌群组成Fig.3 The intestinal microbiota composition of the juvenile sea cucumber A. japonicus at genus level

3 讨 论

3.1 工厂化培育幼参肠道优势菌门特征

仿刺参肠道菌群结构受到环境中微生物、温度、饵料、发育阶段、生理状况等条件的影响[16]。有研究表明,黄、渤海仿刺参肠道、养殖池塘海水和底泥样品中优势菌门均为变形菌门[4,17-18],这与本试验中幼参肠道菌群优势菌门结果一致,但本试验中幼参肠道变形菌门相对丰度较高,药浴前在98%以上,药浴后也在90%以上,远高于之前研究报道的60%～87%,仅与秋季河北省乐亭县仿刺参肠道变形菌门相对丰度[19]相似。在以往的研究中,仿刺参样品规格较大,且均取自野外池塘或浅海水域,而本试验所用仿刺参样品为室内培育的幼参,培养环境相对稳定单一,诸多因素均可能导致本试验仿刺参肠道变形菌门丰度与以往结果相比偏高。肠道细菌能够合成分泌出一些宿主生长发育所必需的维生素、酶、调节因子等,它们将一些不易被宿主吸收的物质分解成易吸收的小分子物质,促进宿主对某些营养成分的吸收,提高宿主消化酶的活性,对促进宿主的新陈代谢有着重要的作用[20]。相比室外散养的仿刺参,工厂化培育的仿刺参苗种具有较快的生长速度,在人工投喂饵料及水质环境等较好的条件下,仿刺参幼参肠道菌群可能会形成其特有的高效促消化结构模式。工厂化培育的仿刺参苗种是否普遍具有肠道变形菌门相对丰度较高的特点,该特点是否与仿刺参的生长速度有所关联,还需要进一步验证。

3.2 药浴后幼参肠道菌群结构变化

药浴后仿刺参肠道细菌多样性先升后降,结合运算分类单元相似性分析和门属水平结构分析,氟苯尼考药浴将幼参肠道菌群结构原有平衡打破,部分原有细菌被抗生素消灭,多种新细菌出现。在药浴后72 h时间段,仿刺参肠道菌群结构变化较大,属水平分析显示,原优势菌属新草螺菌属在药浴后相对丰度24 h降为2%,48 h后恢复至36.7%,72 h恢复至69.9%,总体来说,药浴后幼参肠道菌群结构逐渐趋向药浴前的幼参肠道结构恢复变化。门水平分析显示,幼参肠道优势菌变形菌门相对丰度由98%降至90%,72 h后恢复到96%,酸杆菌门、绿弯菌门、疣微菌门、厚壁菌门均有所提高,新出现的达达菌门、德潘菌门、芽单胞菌门均为土壤和海水中的常见细菌[21-22]。根据细菌在肠道上的定殖力和停留时间,肠道菌群可分为固定菌群或过路菌群,前者是指在肠道中占有特定区域的微生物,后者是指那些不能在健康动物消化道内长期滋生的微生物,除非占据固定菌群让出的特定区域[23]。肠道细菌与外界环境、动物和肠道细菌之间,处在一个相对的动态平衡状态,这种状态对寄主的正常生理功能的维持有着重大意义[24]。药浴后的幼参肠道菌群平衡被打破,固定菌群发生紊乱,环境中的过路菌群趁虚而入,在仿刺参肠道内定殖。过路菌群由一些潜在致病性或非致病性细菌组成,在仿刺参肠道存留数小时、数天或数周,如环境中的过路菌群多为潜在致病性细菌且在短时间内大量繁殖,便可能会引发疾病。

3.3 仿刺参保苗期抗生素的科学使用

通过比较氟苯尼考药浴幼参的肠道菌群结构变化,笔者发现:药浴会打破幼参肠道原有平衡,进而可能会影响到幼参的消化吸收,并增加致病风险。保苗期即仿刺参苗种培育期,倒池属于该时期常规操作。倒池操作过程中难免会造成仿刺参苗种表皮的机械损伤,为防止伤口继发性感染采用抗生素药浴,这也是一些技术人员使用抗生素药浴的出发点,但这种认识显然是存在偏差的,倒池时对健康苗种进行药浴是弊大于利的,实际生产中应摒弃药浴的做法而注重倒池操作的细节,比如调节冲苗水流强度、选用适宜网目的收苗网袋、勤摇动或更换网袋防止网眼堵塞、减少幼参在盆中滞留时间等,可以有效减少表皮受损的参苗数量。

近年来,由于养殖环境污染加重、养殖生产操作不规范等因素,仿刺参养殖病害频发,出现“腐皮综合征”、“肠炎病”等疾病和“一倒没”、“放不住”等现象,一些从业者会使用抗生素进行病害防控,如缺少科学使用的指导,抗生素的滥用会影响养殖动物的质量和安全,导致水环境恶化、药物残留、细菌耐药以及微生态结构失衡[25-26]。笔者认为,在仿刺参保苗期间,除非出现“腐皮综合征”、“肠炎症”等疾病时[27],需要采用农业农村部允许使用的药物进行治疗,其他情况下均无需使用抗生素。保苗期间通过泼洒、拌饲、药浴等方式利用抗生素进行病害防控可能会起到适得其反的效果。近几年的生产实践证明,做好水质调控、饲料检测以及管理操作标准化,保苗期间不使用任何抗生素药物,通过科学合理应用微生态制剂便可达到防控细菌性疾病的目的。

4 结 论

综上所述,抗生素药浴会打破正常生长状态下幼参的肠道菌群平衡,进而可能会影响到幼参的消化吸收,并增加致病风险,因此倒池时不建议采用抗生素药浴。本试验结果可为仿刺参健康养殖提供理论依据和技术支持。