地衣芽孢杆菌复合桑叶提取物对虾夷扇贝的益生作用

米 锐,关晓燕,王庆志,蒋经伟,李华琳,姜苹哲,,徐永平,李淑英,周遵春

( 1.辽宁省海洋水产科学研究院,辽宁 大连 116023; 2.大连赛姆生物工程技术有限公司博士后工作站,辽宁 大连 116620; 3.辽宁省噬菌体应用工程技术研究中心,辽宁 大连 116620 )

虾夷扇贝(Patinopectenyessoensis)属软体动物门瓣鳃纲,为冷水性双壳贝类,具有养殖周期短、味道鲜美、营养价值高等特点,是我国主要的贝类养殖品种[1]。随着虾夷扇贝养殖规模的不断扩大,在养殖过程中出现的种质退化、环境胁迫及病害频发等问题,制约了虾夷扇贝养殖业的健康发展[2-3]。而以致病性弧菌为主的细菌病是虾夷扇贝亲贝促熟、苗种繁育和养殖过程中的常见疾病,具有暴发性强、感染速度快、死亡率高等特点,给虾夷扇贝养殖产业造成巨大的经济损失。由于抗生素类药物的使用易引发细菌抗药性及食品和环境安全等问题,在虾夷扇贝等水生动物的苗种繁育及健康养殖中被严格限制使用。因此,开发生产配方安全、原料新型的抗生素替代品已成为研究热点。绿色环保、营养丰富的饲料添加剂有助于提高虾夷扇贝的非特异性免疫机能及抗病能力,对于提升养殖效果、增加经济效益具有重要意义。

益生菌制剂可以维持宿主的微生态平衡,具有补充营养成分、改善肠道健康、提高饲料利用率和抑制病原菌增殖的功能。作为饲料添加剂使用是机体摄入益生菌最为实用、高效的方式[4-5]。目前,以地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)为主的益生菌制剂受到广泛关注。地衣芽孢杆菌属厚壁菌门,能够厌氧繁殖,易于在肠道内定殖生长。地衣芽孢杆菌稳定性极高,可在高温以及酸性等不利的环境中以内生孢子的形式存在。同时,地衣芽孢杆菌可以分泌多种消化酶、生长因子和抗菌物质,可以有效促进营养成分降解,辅助机体能量代谢,还可以通过营养竞争、空间竞争等方式抑制致病菌的增殖,而对部分有益菌有促进和共生作用[6-8]。作为重要的植物蛋白源,桑叶具有天然、营养、毒副作用小等特点。桑叶提取物中富含多种氨基酸、维生素、多糖类、单宁类及黄酮类物质,具有提高动物生产性能、免疫机能及抗病能力的功能,在机体生长发育、营养代谢和免疫调控等生理过程中发挥显著的作用[9-10]。地衣芽孢杆菌和桑叶提取物作为饲料添加剂已经被广泛应用于水产养殖中,而关于二者联合施用于水产养殖中的报道相对较少。

笔者将地衣芽孢杆菌和桑叶提取物添加到饲料中,开展虾夷扇贝饲养试验及弧菌攻毒试验,评估其在虾夷扇贝养殖中的作用,旨在为虾夷扇贝健康养殖提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用虾夷扇贝、饲料购自大连当地水产品批发市场。虾夷扇贝壳长(70.0±7.4) mm,单体质量(34.6±2.8) g,基础饲料为螺旋藻(Spirulinaplatensis)和鼠尾藻(Sargassumthunbergii)按照质量比1∶1组成的粉末。试验开始前虾夷扇贝于人工控温育苗池暂养10 d。暂养期间保持充气,水温(16±2) ℃,pH 8.0±0.5,盐度30±2。每日换水50%后投喂饲料,饲料日投量为每枚虾夷扇贝1.0×1010个藻细胞。益生菌株经16S rDNA同源分析法鉴定为地衣芽孢杆菌,病原菌为哈维氏弧菌(Vibrioharveyi)。

1.2 试验方法

1.2.1 饲料制备

将冰箱中-80 ℃冻存的地衣芽孢杆菌活化重悬后,按5%的接种比例加入到MSB液体培养基中,30 ℃、180 r/min振荡培养。将地衣芽孢杆菌培养至对数生长期后,离心弃上清液,采用麦氏比浊法调整菌液密度,备用。将新鲜桑叶用蒸馏水清洗干净,匀浆粉碎,加入体积分数75%的乙醇溶液(料液比为1 g∶15 mL),在工作频率为40 kHz、功率为80 W的超声波作用下浸提2 h,过滤去掉杂质,将浸提液浓缩后冷冻干燥得到冻干粉,即桑叶提取物。地衣芽孢杆菌与桑叶提取物在饲料中的添加量分别为107cfu/g和8 mg/g[11-12]。

1.2.2 饲养试验

将暂养后的虾夷扇贝随机分配至相同规格200 cm×100 cm×80 cm水族箱中,每箱50枚。试验共设3个处理组和1个对照组,每组3个平行。其中,对照组只饲喂基础饲料,地衣芽孢杆菌添加组饲喂添加地衣芽孢杆菌的基础饲料,桑叶添加组饲喂添加桑叶提取物的基础饲料,联合添加组饲喂同时添加地衣芽孢杆菌、桑叶提取物的基础饲料。饲养试验持续30 d,饲养条件与暂养时期一致。分别于试验第0、10、20、30天取样测定虾夷扇贝消化酶和免疫酶活性。

1.2.3 取样及酶活性测定

在每个取样时间点从每个试验组随机取3个虾夷扇贝,用2 mL灭菌注射器从虾夷扇贝闭壳肌血窦中抽取血淋巴1.5 mL置于预冷离心管中,4 ℃、4000 r/min(离心半径5.9 cm)离心10 min,取上清液用于测定免疫酶活性。用无菌手术刀解剖虾夷扇贝,分离出消化道并切取直肠组织,无菌生理盐水冲洗后用滤纸吸干,以10倍磷酸盐缓冲溶液(pH 7.5)匀浆10 min,匀浆液于4 ℃、4000 r/min(离心半径5.9 cm)离心10 min,取上清液用于测定消化酶活性。

采用南京建成科技有限公司测试盒测定虾夷扇贝的免疫酶和消化酶活性,酶活性检测重复3次。免疫酶中的酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活性采用磷酸苯二钠法测定,超氧化物歧化酶活性采用WST-1法测定,溶菌酶活性采用比浊法测定。消化酶中的淀粉酶活性采用碘-淀粉比色法测定,脂肪酶活性采用甲基试卤灵底物法测定,胰蛋白酶和纤维素酶活性采用分光光度法测定,具体测定步骤参照试剂盒说明书。

1.2.4 哈维氏弧菌攻毒试验

每组随机取25个虾夷扇贝用于哈维氏弧菌攻毒试验。将活化的哈维氏弧菌接种到2216E培养基上,28 ℃培养24 h,用无菌海水将哈维氏弧菌重悬并稀释至不同密度。通过预试验证实,该株哈维氏弧菌对虾夷扇贝存在致病性,并确定其对虾夷扇贝72 h的半致死密度为107cfu/mL。每枚虾夷扇贝经闭壳肌注射100 μL半致死密度的哈维氏弧菌,攻毒试验设3组平行,持续96 h,每隔8 h观察虾夷扇贝发病情况并统计累积死亡率。攻毒试验期间虾夷扇贝饲养条件与投喂试验一致。

1.2.5 攻毒虾夷扇贝致病菌检测

攻毒试验结束后,从每个试验组随机取3个虾夷扇贝,解剖切取1 cm消化道直肠组织,滤纸沥干后以10倍体积磷酸盐缓冲液(pH 7.5)匀浆处理10 min,匀浆液于4 ℃、4000 r/min(离心半径5.9 cm)离心10 min,用无菌生理盐水将上清液稀释10倍,取200 μL涂布于硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖弧菌选择性培养基,28 ℃倒置培养,2 d后统计各试验组虾夷扇贝消化道弧菌数目。

1.2.6 数据处理

数据用SPSS 21.0软件进行单因素方差分析以及邓肯多重比较,结果以平均值±标准差表示,P<0.05表示差异显著。

2 结 果

2.1 地衣芽孢杆菌和桑叶提取物对虾夷扇贝免疫酶活性的影响

随着试验的进行,各组酸性磷酸酶、碱性磷酸酶活性均逐渐升高,其中联合添加组最高,地衣芽孢杆菌添加组次之,对照组最低(图1a、b)。各组超氧化物歧化酶活性呈先升后降的趋势,其中联合添加组最高,对照组最低,而地衣芽孢杆菌添加组与桑叶添加组的超氧化物歧化酶活性差异不显著(P>0.05)(图1c)。各组的溶菌酶活性均缓慢上升,而联合添加组的增长幅度明显高于其他处理组;试验20 d后,各组溶菌酶活性趋于稳定,对照组的活性最低,地衣芽孢杆菌添加组与桑叶添加组的溶菌酶活性差异不显著(P>0.05)(图1d)。

2.2 地衣芽孢杆菌和桑叶提取物对虾夷扇贝消化酶活性的影响

各组淀粉酶、纤维素酶活性均显著上升,其中联合添加组活性最高,地衣芽孢杆菌添加组与桑叶添加组差异不显著(P>0.05),对照组的活性最低(图2a、b)。除对照组外,各处理组脂肪酶活性均呈先显著上升后缓慢下降的趋势,其中联合添加组和地衣芽孢杆菌添加组活性相对最高,对照组的脂肪酶活性最低(图2c)。在整个试验过程中,胰蛋白酶的活性变化不明显,各处理组之间的胰蛋白酶活性均差异不显著(P>0.05)(图2d)。

图2 地衣芽孢杆菌和桑叶提取物对虾夷扇贝淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶和胰蛋白酶活性的影响Fig.2 Effects of B. licheniformis and mulberry leaf extracts on activities of amylase, cellulase, lipase and trypsin of the Yesso scallop

2.3 地衣芽孢杆菌和桑叶提取物对攻毒虾夷扇贝累积死亡率的影响

地衣芽孢杆菌和桑叶提取物对攻毒虾夷扇贝累积死亡率的影响见图3。注射哈维氏弧菌24 h后,首先在对照组发现死亡个体,之后分别在攻毒后32、40、48 h分别在桑叶添加组、地衣芽孢杆菌添加组、联合添加组发现首个死亡个体。随着攻毒试验的进行,各处理组虾夷扇贝死亡个体数逐渐增加。攻毒96 h时,对照组虾夷扇贝的累积死亡率达到76%,显著高于其他组(P<0.05)。联合添加组虾夷扇贝的累积死亡率最低,为48%,地衣芽孢杆菌添加组与桑叶添加组虾夷扇贝的累积死亡率差异不显著(P>0.05)。

图3 地衣芽孢杆菌和桑叶提取物对攻毒哈维氏弧菌虾夷扇贝累积死亡率的影响Fig.3 Cumulative mortalities of Yesso scallop diets containing B. licheniformis and mulberry leaf extracts after the V. harveyi challenge

2.4 地衣芽孢杆菌和桑叶提取物对攻毒虾夷扇贝消化道弧菌的抑制作用

地衣芽孢杆菌和桑叶提取物对攻毒虾夷扇贝消化道弧菌的抑制作用见图4。对照组虾夷扇贝消化道弧菌数目明显高于其他处理组,地衣芽孢杆菌添加组与桑叶添加组的弧菌数目无明显差异,联合添加组虾夷扇贝消化道弧菌数目最少,抑菌效果最明显。

3 讨 论

3.1 地衣芽孢杆菌和桑叶提取物对虾夷扇贝免疫酶活性的影响

虾夷扇贝没有特异性免疫系统,主要依靠体液中的细胞免疫和体液免疫因子来增强机体的防御能力和免疫机能[13]。酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、超氧化物歧化酶和溶菌酶能够积极参与机体的免疫防御活动、阻断脂质过氧化、消除侵入的致病菌,是衡量虾夷扇贝免疫机能的重要指标[14]。

本试验中,地衣芽孢杆菌和桑叶提取物联合施用时,可更显著地提高虾夷扇贝的酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活性,与Lin等[15]的研究结果相似,表明地衣芽孢杆菌和桑叶提取物能够分泌非特异性磷酸酶或通过诱导激发的形式,提高虾夷扇贝分泌磷酸酶的能力。当二者联合施用时,磷酸酶的响应能力更强,可以激活吞噬细胞更有效地识别和消灭病原体[16]。各组的超氧化物歧化酶活性呈先升后降的趋势,表明在超氧化物歧化酶水平上,虾夷扇贝对地衣芽孢杆菌和桑叶提取物产生了短期适应性。而在适应期后,过量的酶导致机体氧化压力不足,氧化因子缺乏,抗氧化能力下降[17-18]。相对来说,联合添加组具备更强的清除和平衡细胞内活性氧自由基、抑制氧化损伤的能力。各组的溶菌酶活性缓慢上升后趋于稳定。这可能是因为机体需要一段整合时间使溶菌酶进入血淋巴以提供基础免疫,而在虾夷扇贝适应了地衣芽孢杆菌和桑叶提取物的免疫刺激之后,各组溶菌酶活性保持稳定[19]。而相比于其他组,联合添加组可以更有效地水解致病菌细胞壁的糖苷键,起到生物防御的作用。

3.2 地衣芽孢杆菌和桑叶提取物对虾夷扇贝消化酶活性的影响

消化酶活性的高低决定了虾夷扇贝对营养物质消化吸收的能力以及体内营养物质积累的速度,是反映虾夷扇贝消化生理机能的重要指标。虾夷扇贝的消化酶主要为淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶和胰蛋白酶等[20]。相对于肝胰腺等其他组织,虾夷扇贝的消化酶主要由消化系统中的直肠组织分泌产生。为有效评估地衣芽孢杆菌和桑叶提取物诱导扇贝消化酶合成的作用效果,故选取虾夷扇贝直肠组织进行消化酶活性测定。

本试验中,联合添加组虾夷扇贝的淀粉酶和纤维素酶活性显著高于其他组。这表明地衣芽孢杆菌和桑叶提取物联合施用时可以刺激虾夷扇贝分泌更多的淀粉酶和纤维素酶用于营养物质代谢,更高效地将大分子物质分解成易被吸收的小分子物质,有效增强虾夷扇贝的糖类水解能力[21]。除对照组外,各组虾夷扇贝的脂肪酶活性均呈先显著上升后缓慢下降的趋势,这可能是由于地衣芽孢杆菌和桑叶提取物可以刺激虾夷扇贝在短期内分泌并积累过多的脂肪酶,而过饱和的脂肪酶会使机体出现免疫疲劳现象,降低酶与底物的结合能力,导致部分脂肪酶失活[22]。尽管如此,各处理组的脂肪酶活性仍明显高于对照组。在整个试验过程中,各处理组之间的胰蛋白酶活性均无显著差异,这可能是因为地衣芽孢杆菌和桑叶提取物不能有效诱导虾夷扇贝的胰蛋白酶的产生,说明地衣芽孢杆菌和桑叶提取物对各类消化酶活性的影响具有选择性,与虾夷扇贝本身的消化机制及饲料添加剂的种类有关[23]。

3.3 地衣芽孢杆菌和桑叶提取物对虾夷扇贝抵抗哈维氏弧菌感染的影响

哈维氏弧菌是一种海洋致病菌,可通过分泌溶血素、肠毒素、胞外蛋白酶及脂多糖等使病原体从宿主获取营养并通过组织传播,对甲壳类、贝类和鱼类等多种水产动物产生致病作用[24]。

本试验中,地衣芽孢杆菌可增加虾夷扇贝肠道优势菌含量并优化肠道微生物菌群结构,通过竞争性排斥作用抑制弧菌生长[8]。同时,地衣芽孢杆菌还可以通过分泌细菌素类、蛋白类、脂肽类、多肽类、酚类等活性物质来对弧菌产生生物拮抗作用,有效提高虾夷扇贝的抗病能力[4,25]。桑叶提取物具有广谱抑菌功能,其中的水解单宁酸可以降低虾夷扇贝肠道的通透性,阻断弧菌与肠道结合的受体,抑制弧菌感染[26-27]。本试验结果表明,饲料中添加地衣芽孢杆菌和桑叶提取物可显著增强虾夷扇贝抵抗弧菌感染的能力,当二者联合施用时,可以更有效地破坏致病菌的细胞壁,引起细胞裂解,抑制弧菌的氧化磷酸化作用,钝化其致病能力,这也与各组虾夷扇贝免疫酶活性的变化规律一致。因此,相比于其他处理组,联合添加组虾夷扇贝的累积死亡率更低,消化道致病菌更少,抗病效果更明显。

3.4 地衣芽孢杆菌和桑叶提取物的协同增效作用

益生菌和中草药作为饲料添加剂往往单独应用于水产养殖中,而有研究表明,二者复合使用比单独应用效果更好[28]。本试验中应用的地衣芽孢杆菌和桑叶提取物作用过程耦合、互利共栖,具有显著的协同效应。桑叶提取物的有效成分含有葡萄糖苷类化合物,在虾夷扇贝消化道内难以吸收,生物利用度低。而地衣芽孢杆菌在新陈代谢过程中产生的α-糖苷酶和β-糖苷酶是桑叶提取物代谢反应中重要的配糖体水解酶,可将桑叶中的大分子物质分解为更易吸收的活性肽、氨基酸等小分子物质,提高生物活性物质溶出率,利于机体吸收。同时,这些酶具有氧化、甲基化、酯化、还原等多种生物功能,可以催化不同底物,将桑叶提取物中的部分次级代谢产物转化为药理活性物质[29-30]。反之,桑叶提取物可以为地衣芽孢杆菌提供生长所需要的专一性底物,提高其存活率。桑叶提取物中富含蛋白质、微量元素、维生素等多种营养成分及生物活性物质,可以为地衣芽孢杆菌的生长繁殖、新陈代谢提供营养物质[31]。同时,桑叶提取物中的有效成分还可以抑制地衣芽孢杆菌中致病性杂菌的增殖[32]。本试验结果表明,相比于单独添加组,联合施用地衣芽孢杆菌和桑叶提取物可以更有效地提高虾夷扇贝的消化功能、免疫机能及抗病能力。

4 结 论

综上所述,联合施用地衣芽孢杆菌和桑叶提取物,可以显著增强虾夷扇贝的消化功能和免疫机能,有效提高虾夷扇贝抵抗哈维氏弧菌感染的能力。本试验结果对开发和生产绿色健康的水产饲料具有重要参考价值。