光叶苕子(Vicia villosa var.)内生细菌Sz-2 的特性及其对香蕉枯萎病的防治效果

阮彦楠，付利波，番华彩，陈检锋，郑泗军，尹 梅，王 伟，陈 华，王永芬,3，毛 俊，李 舒*，王志远*

（1 云南省农业科学院农业环境资源研究所，云南昆明 650205；2 昆明学院，云南昆明 650214；3 云南省农业科学院热带亚热带经济作物研究所，云南保山 678000）

光叶苕子 (Viciavillosavar.) 是近年南方发现的一种具有能够改善土壤肥力、减少化肥施用量和提高作物抗性的一年生豆科植物，在保障作物高产和构建良好农业生态环境中发挥着不可替代的作用[1]。有研究表明光叶苕子含有部分具有抗病、促生以及抗重金属等多种功能内生菌，种植光叶苕子可以增加土壤中微生物的丰度，提高作物产量和抗性[2]。

香蕉是世界上第一大水果，是重要的经济粮食作物，但是由尖孢镰刀菌古巴专化型4 号生理小种(Fusariumoxysporumf.sp.cubenseTropical Race 4，FOC TR4) 引起的香蕉枯萎病给香蕉产业带来毁灭性破坏。TR4 作为一种真菌性土传病害，其孢子在土壤中可存在数十年之久，且到目前为止尚无行之有效的防治措施[3]。病原菌丝可通过茎叶维管束侵染香蕉植株，导致疏导组织堵塞，营养和水分供应受阻，叶片黄化，严重时整株死亡[4]。为了应对香蕉枯萎病病害肆虐，多使用化学防治和生物防治等方法保护香蕉。虽然化学防治在一定条件下能快速控制病害，但长期使用化学农药不仅会使病原菌产生抗药性，还会破坏土壤微生物活性，致使生态环境失衡。随着农业可持续发展观念的强化，生物防治中有益微生物的应用是目前认为的一种最有潜力防治植物病原真菌的方法，具有安全、绿色、高效等优点，近年来，筛选更多效果好、易培养的生防菌的研究已经逐渐成为香蕉枯萎病防治的热点[5]。

有研究发现，香蕉套作绿肥白三叶草能显著降低香蕉枯萎病尖孢镰刀菌的总体数量，进而减少香蕉枯萎病的发病风险[6]；李朝生等[7]发现，香蕉套种黑皮冬瓜后通过提高土壤pH，降低土壤电导率，提高土壤碱解氮含量，改变土壤细菌群落结构达到降低香蕉枯萎病发病率的目的；也有研究表明，香蕉采用套作模式种植部分豆科绿肥和施用生物有机肥时，均有抑制香蕉枯萎病的效果[8]。以上研究发现，当豆科绿肥与香蕉套作时，可能潜藏着独特的微生物种群结构，降低香蕉枯萎病的发病率。其中还存在一些具有显著铁载体产生潜力的细菌，可通过与植物病原菌竞争铁离子来抑制其菌丝生长和孢子萌发，同时分泌吩嗪、表面活性剂和番红菌素等抗生素活性物质[9]，从而抑制病原菌生长；Yu 等[10]发现了一株拮抗尖孢镰刀菌的假单胞菌BAF.1，其通过产生铁载体来抑制尖孢镰刀菌，抑制率达95.24%。邱美莎等[11]研究发现深色有隔内生真菌X22 既能促生，又能显著抑制香蕉枯萎病；卯婷婷等[12]从猕猴桃根际土壤中分离出一株高效解磷真菌MHT0308 菌株，且对猕猴桃软腐病菌的抑菌率达87.71%；陈阳[13]从水稻中分离出一株内生固氮菌BV6，具有溶磷、产铁载体和拮抗灰霉、稻瘟病菌、指状青霉、尖孢镰刀菌等植物病原真菌的能力；刘彩霞等[14]在森林土壤中分离到两株具有溶解无机磷、有机磷及解钾能力的菌株1020 和2001，且分别对拟盘多毛孢和胶孢炭疽菌具有较好的抑制作用。所以在自然界中广泛存在着具有多元功能的微生物，既能通过分泌铁载体、解磷、解钾、固氮和产生长素来促进植物生长，又能够对植物病原菌产生抑制作用。

以上研究表明，豆科绿肥具有丰富的内生菌且部分内生菌在提高作物抗性和促生方面具有很大的应用潜力，但光叶苕子作为绿肥其内生菌的相关研究还鲜见报道，从中筛选出更多促生防病效果好、易培养的内生菌也是目前研究的一个热点之一。所以本研究以光叶苕子根为研究材料，利用平板对峙法筛选对香蕉枯萎病菌具有拮抗作用且可分泌铁载体、解磷、解钾和固氮的菌株，然后对拮抗促生菌株进行分类鉴定、抑菌测定及香蕉枯萎病盆栽防效试验，从而确定菌株的分类地位及对香蕉枯萎病的生防效果，旨在为光叶苕子绿色化有机菌肥的种植推广和微生物菌肥的研究开发奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试光叶苕子根部样品于2021 年11 月取样，采用五点取样法在云南省昆明市嵩明县绿肥长期定位试验基地 (102°41′E，25°28′N)进行。香蕉品种为巴西蕉，由云南省农业科学院农业生物多样性研究室进行组培扩繁。供试香蕉病原菌为尖孢镰刀菌古巴专化型4 号生理小种 (FusariumOxysporumf.sp.CubenseTropical Race 4，FOC TR4) 菌株15-1，由云南农业科学院农业环境与资源研究所香蕉研究团队，从西双版纳种植田中的巴西香蕉品种分离、鉴定和保存的具有较高毒性和致病性的菌株[15]。

PCR 反应所需的试剂购自北京擎科生物科技有限公司。LB 固体培养基、马铃薯琼脂培养基 (PDA)、无机解磷培养基、解钾培养基和Ashby 无氮培养基配方均参照巩文峰等[16]的文献，铬天青 (chrome azurol S，CAS) 双层显色培养基配方参照申云鑫等[9]的文献。

1.2 拮抗病原菌内生菌的分离与筛选及对TR4 的影响

1.2.1 拮抗病原菌内生菌的分离与筛选 内生菌的分离首先采集光叶苕子非菌根亚根 (直径7～8 mm)，将其表面清洗干净，无菌操作台中称取l0 g 洗净的植物根系，先用75% 的乙醇进行表面消毒，再用0.1%升汞浸泡30 s～1 min，每次消毒完用无菌水冲洗3 次，放入装有9 mL 无菌水的灭菌研钵中，加入少许灭菌的石英砂充分研磨，静置15 min 后取1 mL 稀释至10-3、10-4、10-5、10-6浓度梯度，涂布于LB 固体培养基，将最后一次冲洗光叶苕子组织的无菌水设做空白对照。根据菌落形态，挑选平板上长势较好、生长速度较快的单菌落，划线分离，纯化菌株，-80℃甘油保存。

拮抗菌的筛选采用平板对峙法[17]，初筛使用无菌打孔器打取直径2 mm 的TR4 菌饼接种在PDA 培养基中央，在相隔菌饼2.5 cm 处接种筛选得到的内生菌菌株置于同一平板上，用密封条封好，以没有接种待筛选拮抗菌株的平板作为对照，重复3 次，置于培养箱，28℃条件培养72 h，初步筛选具有抑菌效果的内生菌株。

1.2.2 拮抗菌对TR4 的影响及抑菌活性测定 为了进一步验证对TR4 具有拮抗活性的内生菌，拮抗菌的复筛参考Li 等[18]的平板对峙法进行(图1A)，采用十字划线法将香蕉枯萎病TR4 菌饼接种在新制备的PDA 培养基平板中央，用接种环挑取具有抑菌效果的内生菌株接种在距TR4 菌饼2.5 cm 处，以不接种拮抗菌为对照，28℃下培养7 天，3 次重复，评估抑制效率的结果。采用杂交法测定TR4 菌落的直径，计算平均抑菌效果。

图1 双培养试验接种位置及取样位置示意图Fig.1 Diagram of inoculation position and sampling position in double culture test

抑制率 (%)=[(对照组病原菌生长直径-处理组病原菌生长直径)/(对照组病原菌生长直径-接种菌饼直径)]×100。

1.2.3 拮抗菌发酵液对TR4 的影响 发酵液原液制备：挑取纯化的菌株Sz-2 单菌落接种于LB 液体培养基中，37℃ 220 r/min 震荡培养3 天，得到发酵液原液。发酵液上清液提取：将500 mL 发酵液原液分装于50 mL 离心管中，常温下12000 r/min 离心30 min，弃沉淀保留上清液，用0.22 μm 孔径的滤膜除菌，4℃保存备用。

发酵液处理液抑菌活性测定：以无菌水为对照，采用牛津杯打孔抑菌试验测定发酵液上清液的抑菌活性。在PDA 平板中心距边缘25 mm 处用孔径7 mm 的牛津杯进行打孔，每孔加入100 μL 发酵液处理液，每个处理重复3 次，平板中心位置加入病原真菌。28℃培养7 天后测定发酵液处理液的抑菌率。

1.3 拮抗菌株对TR4 菌丝生长及形态的影响

TR4 病原菌与拮抗菌在28℃双培养7 天后，挑取对峙平板与空白对照的TR4 菌丝于洁净载玻片上制片 (图1B)，利用扫描电子显微镜观察拮抗菌对TR4 菌丝结构的影响。

1.4 根系拮抗内生菌溶磷、解钾、固氮和产铁载体能力测定

配置无机磷培养基、解钾培养基、Ashby 无氮培养基和CAS 检测培养基，在4 种功能培养基上接种以LB 培养的内生拮抗菌菌株，3 个重复；在37℃恒温培养箱中倒置培养7 天后，其中溶磷功能通过有无透明圈来确定，解钾和固氮功能通过观察是否在培养基上生长来确定，产铁载体功能通过观察菌落周围产生橘黄色晕圈来确定菌株能够分泌铁载体，且黄色圈的直径大小与该菌株分泌铁载体能力大小成正比，通过以上方法初步判断菌株的溶磷、解钾、固氮和产铁载体能力[9,16]。

1.5 促生拮抗菌株的鉴定

1.5.1 菌株形态学观察 将菌株在LB 培养基上30℃划线培养24 h，观察并记录菌落形态、透明度、颜色等特征，利用扫描电子显微镜 (蔡司Sigma 300，柏林，德国)观察菌株的显微形态。

1.5.2 促生拮抗菌株的分子鉴定 细菌的16S rDNA 序列在不同的物种间是高度保守的，不同的物种间序列是不一样的，因而对此序列通过PCR扩增、测序，与GenBank 中的已知序列进行比对后，则可判定细菌种类，将其划分到属。将促生拮抗菌株接种于LB 液体培养基中，在37℃、220 r/min的条件下培养24 h。取1 mL 菌液12000 r/min 离心1 min 收集菌体，使用TSINGKE 植物DNA 提取试剂盒 (通用型) 提取菌体DNA。采用通用引物 (委托北京擎科生物科技有限公司合成) 27F/1492R：(5'-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3'、5'-GGTTA CCTTGTTACGACTT-3')对该菌株的16S rDNA 进行扩增，提取的DNA 样品适量稀释后作为PCR 模板，以擎科1×TSE101 金牌mix 进行扩增，扩增体系(50 μL) 各组分如下：1×TSE101 金牌 mix 45 μL，上游引物27F 2 μL，下游引物1419R 2 μL，DNA 模板1 μL。以上扩增体系按以下扩增程序扩增：98℃预变性2 min，其次循环阶段是在98℃下变性10 s，56℃退火10 s，72℃下延伸5 s，共有35 个循环，72℃进行温浴5 min，4℃环境下保存备用。将扩增好的PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳 (2 μL 样品+6 μL 溴酚蓝)，300 V 电压下12 min，获取鉴定胶图。将准备好PCR 产物送至北京擎科生物科技有限公司测序部进行一代测序。随后进行系统发育分析，将测序结果在NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)序列同源性比对，后于GenBank 数据库进行比较分析，选取同源性较高的模式菌株序列作为参比对象，采用MEGA 7.0 邻接法构建系统发育树，Bootstrap值设定为1000，其余均为默认值。

1.5.3 菌株的生理生化性质测定 细菌的生理生化测定参照《伯杰细菌鉴定手册》[19]和《常见细菌系统鉴定手册》[20]进行。

1.6 拮抗菌株Sz-2 对香蕉枯萎病盆栽防效及对香蕉植株的促生作用测定

1.6.1 盆栽前处理 温室盆栽试验于2022 年8 月至11 月进行。将巴西蕉组培苗转入砂基质中进行驯化30 天。选择5～6 片叶的香蕉植株进行盆栽试验，评价TR4 的生物防治和促生长效果。

1.6.2 拮抗菌株发酵原液制备 使用无菌接种环挑取促生拮抗单菌落接种到LB 液体培养基中，在37℃和220 r/min 条件下振荡培养48 h 后，得到发酵液。用无菌水将悬浮液稀释至OD600=1.0，调节发酵液中菌株浓度为1×108cfu/mL。

1.6.3 TR4 尖孢镰刀菌孢子液发酵液制备 在新制备的PDA 培养基上活化TR4 菌株15-1，28℃培养7 天后，刮取活化的病原菌菌丝置于PDB 液体培养基中，在28℃和180 r/min 下振荡培养72 h。然后，用四层无菌纱布过滤菌丝，得到TR4 孢子悬液。用无菌水稀释至1×106cfu/mL 的TR4 孢子溶液，4℃下储存待用。

1.6.4 盆栽试验设计 选择具5～6 叶片的香蕉植株进行盆栽试验，每盆香蕉苗灌根前进行伤根处理。阳性对照组1 (TR4)：用浓度为1×106cfu/mL TR4 孢子发酵液悬液进行灌根处理 (50 mL)；阴性对照组2 (CK)：PDB 液体培养基进行灌根处理 (50 mL)；处理组1 (TR4+拮抗菌) 进行灌根处理：用浓度为1×106cfu/mL TR4 孢子发酵液悬液 (50 mL)+浓度为1×108cfu/mL 拮抗菌株发酵液进行灌根处理 (50 mL)；处理组2 (拮抗菌)：浓度为1×108cfu/mL 拮抗菌株发酵液进行灌根处理 (50 mL)。培养7 天后再次向处理组1 和处理2 灌根等量的拮抗菌发酵原液。所有处理3 次重复。

1.6.5 TR4 生物防治效果及对香蕉促生效果的评价 接种45 天后，分别观察记录香蕉叶片和球茎的发病情况，参考Fan 等[17]的方法计算各组病情指数和防效。叶片病害分级标准：0 级，无症状；1 级，真叶和子叶黄萎面积不超过总面积的50%；2 级，真叶和子叶黄萎面积超过总面积的50%；3 级，叶片枯萎或死亡，只有生长点存活；4 级，整株植物严重枯萎或死亡；球茎病害分级：0 级，球茎无病变；1 级，球茎病变面积为1%～10%；2 级，球茎病变面积为11%～30%；3 级，球茎病变面积为31%～50%；4级，球茎病变面积大于50%。接种第45 天时，测量并记录每个处理香蕉的株高、鲜重、茎粗和叶片数。

发病指数=∑(各级病株数×相对级数值)/(调查总株数×最高病级数值)×100

防治效果(%)=(CK 病情指数-处理病情指数)/CK病情指数×100

2 结果与分析

2.1 拮抗内生菌的分离与筛选

共筛选得到内生菌140 株，其中经双重培养初筛，获得4 株拮抗内生菌，经双培养的二次筛选后，获得一株拮抗效果较好的内生拮抗菌株(表1，图2)，其中Sz-2 的抑菌效果最强，香蕉枯萎病尖孢镰刀菌菌落平均直径为1.95 cm，径向生长平均抑制率达74.30%，发酵液对TR4 的径向生长平均抑制率达31.21%，故将Sz-2 作为后续研究目标菌株。

表1 4 株拮抗菌对香蕉枯萎病TR4 的抑菌效果Table 1 The antibacterial effect of four antagonistic bacteria on banana Fusarium wilt TR4

图2 Sz-2 对香蕉枯萎病TR4 的拮抗效果Fig.2 Antagonistic effect of Sz-2 on banana Fusarium wilt TR4

2.2 拮抗菌株对TR4 菌丝生长及形态的影响

拮抗菌Sz-2 与TR4 经平板对峙双培养7 天后，拮抗菌株抑制TR4 菌丝生长并导致菌丝畸形，交联变形，且孢子数聚集增多。单独培养TR4 对照 (CK)的菌丝正常、光滑、均匀，孢子形态完整，数目正常 (图3 A、B)。与单培养TR4 菌丝形态相比，Sz-2诱导TR4 菌丝明显肿胀，节间缩短，分枝增多，菌丝粗糙 (图3 C、D，箭头1)。菌丝尖端扩张，呈泡状 (图3 C，箭头2)，菌丝在中间扩张或变细 (图3 C、D，箭头3)。衣原体孢子形成，数目增多 (图3 D，箭头4)。

图3 菌株Sz-2 对TR4 的拮抗作用扫描电镜图Fig.3 Scanning electron microscope images of the antagonistic effect of strain Sz-2 on TR4

2.3 拮抗菌Sz-2 溶磷、解钾、固氮和产铁载体能力测定

溶磷、解钾、固氮和产铁载体能力验证结果发现，拮抗菌Sz-2 具有溶解无机磷、解钾和产铁载体能力 (表2，图4)；其中拮抗菌Sz-2 溶磷圈直径大小为3.3±0.1 cm，菌落大小2.4±0.53 cm，溶磷圈直径与菌落直径大小比为1.41±0.26；拮抗菌Sz-2 产铁载体橙黄圈直径大小为3.53±0.15 cm，菌落大小0.57±0.06 cm，橙黄圈直径与菌落直径大小比为6.28±0.67。通过分析发现拮抗菌Sz-2 的产铁载体能力比溶解无机磷能力强，且能在解钾培养基上生长产生粘稠状物质，证明具有解钾能力；在Ashby 无氮培养基不生长，不具有固氮的潜力。

表2 拮抗菌Sz-2 溶磷、解钾、固氮和产铁载体能力Table 2 The ability of Sz-2 to dissolve phosphorus, potassium hydrolysis, nitrogen fixation and siderophore production

图4 拮抗菌Sz-2 的溶磷、产铁载体、解钾和固氮能力Fig.4 Phosphate-solubilizing, siderophore-producing, potassium-dissolving and nitrogen-fixing capacities of antagonistic bacterium Sz-2

2.4 拮抗菌Sz-2 菌株的形态学特征

拮抗菌株Sz-2 在30℃下LB 培养基上培养3 天的形态特征菌落呈浅白色，表面不透明且粗糙，部分菌落中间凸起产生物膜，边缘不规则呈放射状(图5)；其背面的颜色略比正面深，呈黄白色。在无机磷培养基上菌落呈放射状，边缘不规则，菌落大小2.4±0.53 cm (图4A)；在CAS 培养基上生长不良，呈团状，聚集，菌落大小0.57±0.06 cm (图4B)；在解钾培养基上菌落呈淡黄色，有粘液状物质形成，菌落大小约2.3±0.06 cm (图4C)。电镜扫描 (SEM)结果显示，细菌两端平滑，呈短杆状或肾状，细菌长度大小为1.2～1.75 µm，宽度大小为0.82～0.95 µm(图5)。

图5 拮抗菌株Sz-2 的形态Fig.5 Morphology of antagonistic strain Sz-2

2.5 拮抗细菌SZ-2 的分子鉴定

以菌株Sz-2 基因组为模板，经16S rDNA PCR扩增，其产物测序后得到1378 bp 的基因片段。将测序所得结果提交至NCBI 数据库进行Blast 序列比对，选取14 株与Sz-2 同源性较高的菌株和模式菌株序列通过MEGA 7.0 构建系统发育进化树，构建菌株系统进化树 (图6)。生理生化测定结果 (表3) 显示，菌株Sz-2 为革兰氏阴性细菌，接触酶、氧化酶、赖氨酸脱羧酶、β-半乳糖苷酶、精氨酸双水解酶、明胶水解、硝酸还原反应、纤维二糖、柠檬酸反应、葡萄糖发酵反应、酪素水解等均为阳性，吲哚反应、淀粉水解、产H2S 反应、鸟氨酸脱羧酶、脲酶反应为阴性。结合菌株形态学特征以及细菌生理生化指标测定结果，将菌株Sz-2 鉴定为嗜麦芽寡养单胞菌。

表3 拮抗菌Sz-2 的生理生化测定Table 3 Physiological and biochemical determination of antagonistic bacterium Sz-2

图6 基于16S rDNA 序列构建的菌株Sz-2 系统发育进化树Fig.6 Phylogenetic tree of strain Sz-2 constructed based on 16S rDNA sequence

2.6 菌株Sz-2 对香蕉枯萎病盆栽防效及对香蕉植株的促生效果

2.6.1 菌株Sz-2 对香蕉枯萎病盆栽防效 接种45 天后，仅接种TR4 的对照组 (CK+TR4，图7A) 叶片变黄，植株发育不良，下部叶枯死脱落，且部分香蕉苗整株枯死，发病程度较高；而处理组1 (尖孢镰刀菌孢子发酵液悬液+拮抗菌Sz-2 发酵溶液) 的大部分叶片保持健康 (图7C)，植株生长良好，偶有发病，但发病程度较低，说明拮抗菌Sz-2 对TR4 的侵染起到了一定的抑制作用，这与Fan 等[17]和Li 等[18]的研究结果相似，而处理组2 (拮抗菌Sz-2 发酵溶液) 和阴性对照组2 (LB 液体培养基) 无发病情况。此外，在球茎分裂生长后，Sz-2 处理组1 的球茎几乎没有被TR4 菌丝侵染 (图7C)，而仅接种TR4 的对照组香蕉苗球茎纵剖面褐变明显，球茎的颜色为棕褐色或棕黑色 (图7A)，拮抗菌Sz-2 抑制了TR4 侵染植株球茎。综上所述，拮抗菌Sz-2 可以显著抑制病原菌对香蕉叶片和球茎的侵染，降低香蕉枯萎病的发病情况。

图7 拮抗菌株Sz-2 的生防效果及促生作用效果Fig.7 Biological control effect and growth-promoting effect of antagonistic strain Sz-2

通过盆栽试验调查表明，拮抗菌Sz-2 对TR4 病原菌有显著的抑制作用。其中Sz-2 处理香蕉球茎和叶片的病情指数均显著低于对照组 (CK+TR4)，而且对香蕉球茎和叶片的防治效果可达69.66%±8.58%和84.60%±5.17% (表4)。

表4 菌株Sz-2 对TR4 的生物防治效果Table 4 Biological control effect of strain Sz-2 on TR4

2.6.2 拮抗菌Sz-2 对香蕉的促生长作用 接种生物菌株Sz-2 对香蕉植株的生长有明显的促进作用(表5)。基于拮抗菌Sz-2 香蕉盆栽试验的分析，结果显示，与空白对照组CK 相比，只接种Sz-2 对香蕉叶片数无显著影响，而对香蕉的茎粗、鲜重和株高有显著的影响，香蕉的茎粗、鲜重和株高分别提高了6.01 mm、83.3 g 和11.82 cm；而只接种TR4 与空白对照组CK 相比，香蕉的叶片数和株高差异显著，叶片数明显低于对照组，株高和茎粗却大于对照组；综上表明当接种Sz-2+TR4 时，在有TR4 的致病作用干扰下，与只接种TR4 相比，Sz-2 能够显著提高香蕉的叶片数、茎粗、鲜重和株高；接种拮抗菌Sz-2+TR4 与只接种Sz-2 相比时，其相关的促生指标显著低于只接种Sz-2 处理组，说明TR4 依然对香蕉的生长产生了一定的影响，促生拮抗菌Sz-2 的接种无法完全消除TR4 对香蕉生长的抑制作用，只能在一定程度上改善香蕉的生长。以上研究说明该Sz-2 对香蕉苗不仅具有较高的防病效果，而且还对香蕉具有显著的促生效果，为香蕉促生抗病菌株的进一步田间开发应用提供一定的理论依据。

表5 拮抗菌Sz-2 对香蕉的促生长效果Table 5 Growth-promoting effects of antagonistic bacterium Sz-2 on banana

3 讨论

香蕉枯萎病作为一种严重危害香蕉产业的真菌性土传病害，尚无有效的防治方法，带菌的吸芽、病株残体及带菌土壤都可以作为病原菌的传染源[3]，目前利用化学药剂来防治香蕉枯萎病病原菌TR4是一种迅速有效的方法，但往往会对土壤和水体环境造成破坏且过度使用易诱导病菌产生抗药性。以现在可持续发展的农业生产目标来看，绿色环保无污染的生物制剂成为目前研究的热点，生物防治是最有潜力和有效的方法，具有安全、有效、持久等优点[5]。植物内生菌作为一种潜在的生物防治资源，其可以分泌多种抗菌物质和代谢产物抑制植物病菌，而且还可以在植物中定殖[21]。本研究从光叶苕子根内分离得到一株高效拮抗菌Sz-2，通过对其形态学、分子鉴定、生理生化特征进行分析，将菌株Sz-2 鉴定为嗜麦芽寡养单胞菌 (Stenotrophomonas maltophilia)，对菌株进行拮抗测定，发现内生菌株Sz-2 可以在香蕉植株体内外表现出对TR4 的显著抑制作用。目前，国内外利用嗜麦芽寡养单胞菌对香蕉枯萎病原菌TR4 进行抑制的研究文献较为少见，嗜麦芽寡养单胞菌在土壤、水体、空气以及动植物体中广泛存在，虽然其具有致病性和耐药性，但其在自然界中的广泛存在性必定和自然界具有很好的兼容性[22]。近年来，分离筛选出一系列具有良好生物防治效果的寡养单胞菌来开发生物菌剂逐渐成为热点。Badri 等[23]从水稻根部和根际分离到一株嗜麦芽寡食单胞菌，能通过分泌β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶来显著的抑制水稻稻瘟病，且显著提高了株高、根长、每穴分蘖数、地上部和根系干重等促生参数；Aktas 等[24]分离获得一株几丁质降解菌，经鉴定为嗜麦芽寡养单胞菌，可以有效减少病原真菌的生长，并降解马铃薯甲虫外骨骼几丁质结构；Zahra 等[25]分离出一株嗜麦芽寡养单胞菌菌株UN1512，能够抑制草莓炭疽病的致病原，并且产生的VOCs 能够促进番茄幼苗的生长，而且也有研究证明嗜麦芽寡养单胞菌能产生几丁质酶[26]，所以嗜麦芽寡养单胞菌被用于生防菌防治植物病原菌具有很大的生防潜力。本研究中分离得到的拮抗菌Sz-2 也能抑制病原菌生长，电镜扫描结果显示，Sz-2 作用下TR4 菌丝生长畸形，交联变形，且孢子数聚集增多，表明Sz-2 对TR4 的生长产生了显著的影响。对香蕉枯萎病盆栽防效试验结果显示，菌株Sz-2 能较好的抑制TR4 对香蕉植株的侵染，且对香蕉球茎和叶片的防治效果可达69.66%±8.58%和84.60%±5.17%，推测其生防机理为：通过产生抗菌活性物质硝吡咯菌素、番红菌素和吩嗪[27-28]及几丁质酶[26]、葡聚糖酶[23]、蛋白酶、产生铁载体和小分子脂肽类物质[29]等来抑制病原菌。由于几丁质存在于昆虫的外骨骼和真菌的细胞壁中，因此分泌几丁质酶的菌株可以酶解昆虫的外骨骼和真菌的细胞壁，干扰其生长[24,30]；而在真菌细胞壁中葡萄糖是主要的组成成分，葡聚糖酶可以水解真菌细胞壁中的葡萄糖链，进而阻断病原真菌生长，且对孢子萌发和附着胞形成具有抑制作用[30]；硝吡咯菌素已被证明具有较强的抗病原真菌活性，有研究报道嗜麦芽寡养单胞菌能对致病菌的生长产生抑制作用，被广泛用于抵抗真菌病害[27-31]；细菌铁载体可与植物竞争根际土壤周围有限的铁，使病原菌无法吸收足够的铁元素，生长繁殖受到抑制，从而减轻对植物的危害，起到生物防治作用[29]；但也存在一种可能是细菌通过溶解无机磷、解钾和提供铁来促进植物生长，进而提高植物体的抗病虫害能力，这也是一种潜在机制[9]，但具体的生防机理仍需后续试验对其发酵液进行分析。

目前，寡养单胞菌属的细菌在调节植物生长、高效聚磷和产铁载体方面表现出良好的应用前景，应用比较广泛。磷作为植物生长的必需营养元素，是植物体内众多化合物的成分，参与植物的代谢过程，而土壤中的磷往往以有机无机态存在，植物难以利用，所以具有溶磷功能的细菌具有很大的开发潜力[32]。唐梦君[33]分离出一株高效聚磷和降解有机磷农药的多功能菌株MET70，经鉴定为嗜麦芽寡营养单胞菌，且还具有促进作物生长的功能；铁载体是在缺铁土壤环境中部分微生物分泌的铁螯合物，具有螯合Fe3+能力，可将土壤中存在的一些难溶性Fe3+转化为菌体易利用的铁，进而供给植物吸收利用[29]。徐敬昭等[29]从土壤中分离得到菌株S35，鉴定为嗜麦芽寡养单胞菌，具有蛋白酶和铁载体产生能力，在植物促生方面具有一定的应用潜力；Santos 等[28]分离得到具有显著铁载体产生潜力和分泌抗生素活性物质的促生拮抗菌；嗜麦芽寡养单胞菌在解钾方面的研究较少，但杨晓帆等[34]也分离出一株具有降解难溶性钾的促生荧光假单胞菌，表明假单胞菌属可能具有解钾的潜力。上述研究发现的菌株在植物促生方面与本研究发现的菌株Sz-2 功能相类似，也具有溶解无机磷、解钾、产铁载体的促生功能，对香蕉苗具有显著的促生效果[28-29,33-34]。另外，在本研究中发现，单独接种TR4 的香蕉株高大于空白对照组，猜测可能是TR4 发酵液中含有部分活化的营养物质，导致香蕉株高增加，而且单独接种TR4 的香蕉茎粗也大于空白对照组，这与Fan 等[17]和Li 等[18]的研究不一致，推测可能的原因是TR4 菌丝侵入香蕉球茎输导组织中，导致香蕉茎维管束组织堵塞，香蕉球茎膨大，空腔变多[2]；当接种Sz-2+TR4 处理与单独接种TR4 相比时，香蕉的叶片数、茎粗、鲜重和株高均高于只接种TR4，且差异显著，这与Fan 等[17]和Li 等[18]的研究结果相符。综上表明，寡养单胞菌是一个功能丰富的细菌，具有调节植物生长、高效聚磷、产铁载体和解钾等促生特性。

光叶紫花苕作为云南主推绿肥及农田主要间套作作物，挖掘其根部有益菌菌株，不但有助于开发潜在的工程菌资源，同时可作为菌剂结合绿肥研制功能型绿肥。种植香蕉是云南热带亚热带地区农业的主要产业之一，当前该产业受到了香蕉枯萎病的严重威胁。光叶紫花苕作为香蕉产区主要的覆盖作物之一，经过对其根部生防拮抗菌的筛选，目前已鉴定出一株强拮抗TR4 的内生菌株，拮抗菌株嗜麦芽寡食单胞菌 (Stenotrophomonasmaltophilia) Sz-2 抑病机制及其大田防治效果还有待进一步研究和验证。虽然从植物根内分离出的嗜麦芽寡食单胞菌Sz-2与临床分离出的菌株相比致病性较低，但仍可能对人体和动物产生危害[35]。建议选择利用嗜麦芽寡食单胞菌的工程菌或细菌代谢分泌物作为生物农药进行病害防治；或通过对具有生防功能的嗜麦芽寡食单胞菌菌株中的致病基因和耐药基因敲除，降低其致病性和耐药性[36-37]；或通过基因工程和代谢工程改造，异源表达嗜麦芽寡食单胞菌相关活性成分的基因或基因簇，提高抑菌代谢产物的发酵效价，为微生物农药产业化生产提供安全保障[29,38]。本研究表明，光叶紫花苕根内的Sz-2 菌株对香蕉枯萎病具有较好的防治作用，且对香蕉植株具有一定的促生效果，可作为研制香蕉枯萎病生防菌剂的候选菌株资源，同时可作为菌剂结合绿肥研制具有防控香蕉枯萎病的功能型绿肥，为香蕉促生抗病菌株的进一步田间开发应用提供一定的理论依据。

4 结论

菌株Sz-2 对香蕉枯萎病具有较好的防治作用，且对香蕉植株具有一定的促生效果，可作为研制香蕉枯萎病生防菌剂的候选菌株资源。