circ_BIRC6靶向miR-363-3p调控胃癌细胞增殖、迁移和凋亡

韩兴瑞 杨柳 姚世新

(临清市人民医院普外科,山东 临清 252600)

胃癌发病率、死亡率分别在恶性肿瘤排行榜居第五位、第三位〔1〕。尽管胃癌发病率有所降低,但高恶性程度和早期转移仍是导致预后差的重要原因。识别胃癌进展中的潜在分子靶点可为胃癌的诊疗提供思路。非编码RNA(ncRNA)可在多个水平上调节癌症相关基因表达,在癌症生物学中起着关键作用〔2〕。不同类型的ncRNA如环状RNA(circRNA)可与miRNA相互作用调节癌细胞生物学行为〔3〕。研究报道circRNA杆状病毒IAP重复序列蛋白(circ_BIRC)6在肝癌中表达增加,敲低circ_BIRC6表达可减少肝癌细胞增殖和转移能力,circ_BIRC6可能作为肝癌预后标志物和治疗靶点〔4〕。miR-363-3p是circ_BIRC6的潜在靶点。miR-363-3p已被报道影响胃癌细胞的增殖和转移,并与多种肿瘤的诊断和预后有关〔5～7〕。但circ_BIRC6靶向miR-363-3p调控胃癌进展尚未见报道。本研究通过分析circ_BIRC6在胃癌中表达水平,并以miR-363-3p为切入点探讨其在胃癌进展中的调控机制。

1 材料与方法

1.1组织来源 以2018年7月至2019年12月在临清市人民医院接受根治性手术的37例胃癌患者的胃癌组织和与其对应的正常癌旁组织为研究对象。其中男22例,女15例,年龄32～75岁,平均(62±6.15)岁。组织立体后,立即置于液氮中冷冻,后在-80 ℃下储存。所有入组患者经病理证实为胃癌,其在术前未接受任何抗肿瘤治疗。实验前,所有患者签署知情同意书,并获得医院伦理委员会批准。

1.2细胞和试剂 人胃癌细胞HGC-27、人正常胃黏膜细胞GES-1购自中国典型培养物保藏中心;总RNA提取试剂盒、FastQuant逆转录试剂盒、SYBR Select Master Mix购自北京天根生化科技公司;重组荧光素酶报告载体、si-NC、si-circ_BIRC6、miR-NC、miR-363-3p、anti-miR-363-3p、anti-miR-NC购自北京六合华大基因公司;细胞计数试剂盒(CCK-8)购自南京建成生物工程研究所;膜联蛋白Ⅴ-异硫氰酸荧光素(Annexin Ⅴ-FITC)凋亡检测试剂盒购自南京诺唯赞生物公司;Transwell小室购自美国Corning公司。

1.3细胞培养 将HGC-27细胞、GES-1细胞分别接种于RPMI1640培养基中,加入10%胎牛血清、1%青链霉素双抗,放入37 ℃、含5%CO2温箱孵育,细胞长满培养瓶的80%时进行消化传代。

1.4实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测circ_BIRC6和miR-363-3p表达 总RNA提取试剂盒提取组织样本、HGC-27细胞、GES-1细胞的总RNA。用FastQuant逆转录试剂盒合成cDNA,再用SYBR Select Master Mix进行RT-qPCR以分析circ_BIRC6和miR-363-3p表达。GAPDH、U6分别作为circ_BIRC6、miR-363-3p检测时的内参基因,2-△△Ct法计算circ_BIRC6、miR-363-3p表达量。实验引物如下:circ_BIRC6上游引物:5′-TGAAAGGTTCTTGCACGCAT-3′,下游:5′-TGA AAGGTTCTTGCACGCAT-3′;GAPDH上游引物:5′-CAGAACATCATCCCTGCCTCTAC-3′,下游:5′-ATGAAGTCAGAGGAGACCACCTG-3′;miR-363-3p上游引物:5′-GCCGAGAATTGCACGGTAT-3′,下游:5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′;U6上游引物:5′-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3′,下游:5′-AAATATGGAACGCTTC-ACGA-3′。

1.5实验分组 将对数期HGC-27细胞以2×104个/孔的密度接种24孔板,在细胞铺满培养板底部50%时用Lipofectamine2000将40 nmol/L寡核苷酸转染至HGC-27细胞。根据转染物不同将HGC-27细胞共分为si-NC组、si-circ_BIRC6组、miR-NC组、miR-363-3p组、si-circ_BIRC6+anti-miR-NC组和si-circ_BIRC6+anti-miR-363-3p组。

1.6CCK-8法检测细胞增殖 将转染细胞以5×103个/孔的密度接种96孔板,培养48 h后吸尽培养液,每孔加入10 μl CCK-8试剂和90 μl完全培养基,继续孵育2 h,在酶标仪上测量450 nm处的吸光度(A)。抑制率(%)=(1-实验A/对照A)×100%。

1.7流式细胞术检测细胞凋亡 收集转染48 h细胞,加入1×结合缓冲液调整细胞密度为2×105个/ml。取500 μl细胞悬液加入流式管,依次加入Annexin V-FITC(5 μl)、碘化丙啶(5 μl)避光染色20 min。混匀细胞,通过流式细胞术评估细胞凋亡情况。

1.8平板克隆实验检测细胞克隆能力 将转染48 h以2×102个/孔的密度接种在直径为6 cm的培养皿中,轻旋平板使细胞分散均匀。放入培养箱孵育,中间适时换液,孵育10～12 d当出现时细胞集落时终止培养。磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗后,用4%多聚甲醛固定细胞集落,0.1%结晶紫染色。显微镜下计数>50个细胞的集落数。

1.9Transwell实验检测细胞迁移 将转染48 h细胞悬浮在无血清培养基中调整细胞密度为2×105个/ml。每组取200 μl细胞悬液加至Transwell小室的上室,同时将含有10%胎牛血清的600 μl培养液加至下室。放入培养箱孵育24 h,用甲醇固定穿膜细胞,用0.1%结晶紫染色。显微镜下观察、计数,取5个视野细胞数均值表示细胞迁移数量。

1.10双荧光素酶报告实验 将含有miR-363-3p结合位点的circ_BIRC6野生型(WT)序列及不含上述位点的突变型(MUT)序列分别克隆到pGL3荧光素酶载体中,获得重组载体WT-circ_BIRC6和MUT-circ_BIRC6。用Lipofectamine2000将重组载体分别与miR-363-3p mimics、miR-NC共转染HGC-27细胞。用双荧光素酶报告基因检测转染48 h细胞的荧光素酶活性值。

1.11统计学方法 采用SPSS20.0软件行t检验。

2 结 果

2.1circ_BIRC6和miR-363-3p在胃癌组织、细胞中的表达 与癌旁组织(0.80±0.13)比较,胃癌组织中circ_BIRC6表达水平(2.27±0.21)显著升高(t=36.204,P<0.05);与癌旁组织(1.02±0.14)比较,胃癌组织中miR-363-3p表达水平(0.57±0.10)显著降低(t=15.910,P<0.05)。与人正常胃黏膜细胞(0.34±0.05)比较,胃癌HGC-27细胞中circ_BIRC6表达水平(1.00±0.00)显著升高(t=39.600,P<0.05);与人正常胃黏膜细胞(9.27±0.21)比较,HGC-27细胞中miR-363-3p表达水平(4.04±0.15)显著降低(t=60.800,P<0.05)。

2.2下调circ_BIRC6对HGC-27增殖、凋亡、迁移的影响 与si-NC组比较,si-circ_BIRC6组HGC-27细胞中circ_BIRC6表达水平显著下降(P<0.05)。与si-NC组比较,si-circ_BIRC6组HGC-27细胞抑制率、凋亡率显著升高,克隆形成数、迁移细胞数显著减少(均P<0.05)。见表1和图1。

图1 下调circ_BIRC6诱导HGC-27凋亡

表1 下调circ_BIRC6对HGC-27增殖、凋亡、迁移的检测

2.3circ_BIRC6靶向调控miR-363-3p Starbase预测到circ_BIRC6序列中存在miR-363-3p的结合位点,见图2。与miR-NC组比较,转染miR-363-3p降低了HGC-27细胞中WT-circ_BIRC6的荧光素酶活性(P<0.05),而对MUT-circ_BIRC6的荧光素酶活性无显著影响,见表2。与si-NC组(1.00±0.00)比较,si-circ_BIRC6组HGC-27细胞miR-363-3p表达水平(3.56±0.21)显著升高(t=36.571,P<0.05)。

图2 circ_BIRC6和miR-363-3p的互补序列

表2 双荧光素酶报告实验

2.4miR-363-3p对HGC-27增殖、凋亡、迁移的影响 与miR-NC组比较,miR-363-3p组HGC-27细胞中miR-363-3p表达水平、细胞抑制率、凋亡率显著升高,克隆形成数、迁移细胞数显著减少(均P<0.05)。见图3、表3。

图3 miR-363-3p诱导HGC-27凋亡

表3 miR-363-3p对HGC-27增殖、凋亡、迁移的影响

2.5抑制miR-363-3p逆转下调circ_BIRC6处理的HGC-27增殖、凋亡、迁移的影响 与si-circ_BIRC6+anti-miR-NC组比较,si-circ_BIRC6+anti-miR-363-3p组HGC-27细胞miR-363-3p表达水平、细胞抑制率、凋亡率显著降低,克隆形成数、迁移细胞数显著增加(均P<0.05)。见表4、图4。

图4 抑制miR-363-3p可减弱下调circ_BIRC6对HGC-27凋亡的诱导作用

表4 抑制miR-363-3p可逆转下调circ_BIRC6对HGC-27增殖、凋亡、迁移的作用

3 讨 论

circRNA已被证实参与胃癌的不同生物学过程,并作为致癌或抑癌因子调控胃癌进展。研究报道circ_0032627在胃癌中高表达显著增加癌细胞增殖能力〔8〕。circ_0000190在胃癌中低表达,其异位表达可诱导细胞凋亡和周期阻滞,抑制细胞迁移,抑制胃癌进展〔9〕。本研究结果提示,circ_BIRC6可能在胃癌中发挥功能。既往研究显示肝癌中circ_BIRC6表达增加,紫杉醇通过下调circ_BIRC6表达来抑制细胞增殖和加速细胞凋亡,从而抑制肝癌的发生〔10〕。circ-BIRC6通过与miR-4491结合并负调控miR-4491在肺癌中发挥增殖、迁移抑制和凋亡促进作用〔11〕。本研究功能分析显示,转染si-circ_BIRC6下调circ_BIRC6表达后HGC-27细胞的增殖、迁移和克隆能力均受到抑制,而细胞凋亡率显著增加,这与下调circ_BIRC6在肝癌、肺癌中的抑制作用相似〔4,11〕,表明circ_BIRC6在胃癌进展中起着致癌作用。

circRNA已被证实主要通过吸附miRNA在癌症发展中发挥作用。例如,circ_100269通过靶向下调miR-630来抑制胃癌进展〔12〕。circ_100782可与miR-574-3p相互作用,下调抑癌基因Rb表达水平,从而促进胃癌的增殖和转移〔13〕。本研究检测miR-363-3p在胃癌组织、细胞中表达较低,并通过双荧光素酶报告基因检测证实miR-363-3p是circ_BIRC6的直接靶点。研究报道miR-363-3p低表达与肺癌细胞吉西他滨耐药有关〔14〕,过表达miR-363-3p通过抑制上皮-间质转化可抑制肺癌细胞迁移和侵袭〔15〕。miR-363-3p还可与lncRNA FEZ家族锌指1反义RNA1(FEZF1-AS1)相互作用,并介导沉默FEZF1-AS1对胃癌干细胞增殖、迁移的抑制作用,降低其体内致瘤能力〔16〕。下调circRNA钙黏蛋白相关蛋白基因(circCTNNA1)可上调miR-363-3p表达水平,抑制结直肠癌细胞增殖、周期进展和转移〔17〕。本研究结果与之前报道miR-363-3p的抑癌作用吻合〔18〕。过表达miR-363-3p和下调circ_BIRC6的抗胃癌作用相似,下调circ_BIRC6表达可促进miR-363-3p表达,这提示下调circ_BIRC6在胃癌的作用可能依赖于miR-363-3p表达增加。本研究结果表明,下调circ_BIRC6通过上调miR-363-3p表达来减少胃癌细胞增殖、迁移并促进细胞凋亡。