试论牛卵母细胞体外受精技术

王海波

（梁山县畜牧兽医事业发展中心，山东 济宁 272600）

牛卵母细胞体外受精是指在脱离母体的情况下，人为创造母牛体内繁殖条件，在牛体外完成精卵结合，培育出受精卵并在体外培养至桑椹胚或是囊胚阶段，将胚胎移植到母牛体内孕育胎儿。体外受精是繁育犊牛的重要技术，在牛繁殖领域应用普遍，涉及到的技术有牛卵母细胞的采集、成熟培养与判断，牛精子的筛选、获能，以及具体的受精操作等。针对技术应用关键节点及技术参数、操作细节的分析研究，最终达到获取高质量胚胎的目的，助力于养牛业的高质量发展。

1 牛卵母细胞体外采集与培养技术

1.1 牛卵母细胞体外采集技术

1.1.1 采集方式 常用的动物卵母细胞采集方式如下：（1）直接采集成熟的卵母细胞，采用超排技术从动物的输卵管采集，但不适用于牛这种大型动物；（2）活体采卵，选择繁殖性能优秀的母牛，借助腹腔镜直接采集，对采集母牛的繁殖性能影响较小；（3）从屠宰场获取，宰杀母牛后直接采集牛卵巢。该采集方式简单、直接、成本低，可大批量采集。

1.1.2 采集技术 在从屠宰场获取牛卵巢后，将其放入保温瓶中，瓶中事先装入用生理盐水稀释的硫酸庆大霉素，温度大约是30 ℃，用于保持牛卵巢的新鲜度。在1 h 内完成卵泡的收集，在实验室环境下，使用生理盐水清洗干净牛卵巢，然后使用注射器直接吸取卵泡，获取卵泡液，准备进行体外成熟培养。

1.2 体外成熟培养 使用体视显微镜筛选质量好的卵母细胞用于体外成熟培养，将筛选出的卵母细胞放入培养液中，培养液中含有17-E2 的中央记忆型T 细胞1.5 μg/mL；胎牛血清10%，促黄体生成素20%；卵泡刺激素20 μg/mL。将培养液放入经过温度校正后的培养箱中，温度调整至38～39 ℃，气象条件为5%的CO2，培养时间22～24 h，需根据牛卵母细胞采集时的成熟情况，适当延长1～2 h，但不可超过26 h，一旦超过牛卵母细胞将进入老化期。

1.3 体外成熟判定 在培养24 h 后进行牛卵母细胞的成熟检查，当其进入第二次减数分裂中期则判定为成熟。由于牛卵母细胞成熟需经历第一次与第二次减数分裂期，整个成熟过程复杂，成熟判定难度较大。因此一般情况下以生发泡破裂或是卵丘细胞扩展为判断标准，以显微镜检查卵丘细胞扩展为例，1 级成熟卵，卵丘细胞扩展程度超过裸卵直径的3 倍，2 级则是2 倍，3 级为轻度扩展，大于3 级的情况下则可判定牛卵细胞成熟，具备进行体外受精的条件。

2 牛精子体外获能技术

牛精子体外获能是提高受精率的重要方式，只有其在母牛的生殖道内停留一段时间，在适宜的温度、pH 值、渗透压等条件下，牛精子发生一系列的变化后获取受精能力。如果直接将精子与牛卵母细胞结合，牛精子在未获能的情况下，受精率非常低。所以在牛卵母细胞体外受精过程中，精子体外获能技术的应用是其中的关键环节，在体外环境下诱导牛精子获能，进一步的培养其受精能力。

2.1 影响获能因素 精子体外获能技术是创造与精子体内获能相似的条件，促进牛精子正常的生理与生行反应。通过牛精子体内获能过程的分析，确定了如下影响牛精子获能因素：（1）精子来源，牛精子获能时间大约为1 h，牛采精部位的不同会直接影响到牛精子获能，在精子体外获能操作过程中，需重点关注该影响因素。

（2）温度，牛精子所处获能环境细微的温差变化对精子获能有着一定的影响，经过大量的实践发现，牛精子体外获能最佳温度是38.5～39 ℃，大部分哺乳动物是37～38 ℃。

（3）pH 值，最佳pH7.4～8.0，偏高会减少体外获能时间，过高则会杀死精子，偏低则增加获能时间。

（4）渗透压，渗透压在295～315 mOsm/L 的条件下，牛精子体外获能效果最好。

（5）钙离子载体，其对牛精子顶体反应有着积极作用，有助于糖酵解，为精子运动提供充足的能量。钙离子载体与钙离子形成复合物，进入精子促进其顶体反应。但如果钙离子载体浓度过高，作用过于强烈，作用时间过长会引起精子死亡。

（6）氨基多糖，氨基多糖有利于钙吸收，促进牛精子发生顶体反应。但氨基多糖的类型不同，影响着牛精子的获能水平。比如在牛精子液体中添加肝素10～50 μg/mL，处理10～50 min，诱导牛精子体外获能效果良好。

（7） 高离子强度液，使用渗透压为380 mOsm/L 的高离子强度液氯化钠处理牛精子，置换精子表面的抗原物质，刺激牛精子的顶体反应。

（8）咖啡因，具有抑制环腺苷酸二酯酶的作用，提升精子活力，与钙离子载体、肝素等联合运用，可增加牛精子获能的水平。

（9）血清白蛋白，其为大分子物质，在处理牛精子过程中，与精子膜中的胆固醇结合，减少了精子脂肪，释放精子活力，提高牛精子的受精率。

2.2 精子筛选方法 未经处理的牛精液中含有一些有害物质，采用精子预处理方法去除其中的精清、死精子、弱精子等，筛选出适合体外受精的精子，以改善精子获能。比较常用的处理方法有精子上浮法、Percoll 密度梯度分离法、离心洗涤法等。精子上浮法预处理较为简单，解冻精子后放入TALP培养液中，静置大约1 h，提取上浮的精子。Percoll密度梯度分离法，借助Percoll 大分子硅胶颗粒离心处理，平衡分离精子，使不同密度的精子分布在不同密度的梯度中。离心洗涤法适用于冷冻精液，主要是去除冷冻保护剂与精浆蛋白，但在洗涤过程中容易损伤精子。

2.3 获能操作方法 牛精子体外获能选用BO 液，在其中添加25 μg/mL 肝素钠，6 μg/mL 牛血清白蛋白，培养液pH 值调整至7.6。采用精子上浮法筛选出优质精子70 μL，制作成精子悬浮液。在培养皿上制作3 个100 μL 的受精液微滴，每个微滴上滴入3 μL 的精子悬浮液，然后放入CO2浓度为5%，38℃的培养箱中，牛精子持续获能60 min。

2.4 检测精子质量 在牛精子获能操作过程中，使用显微镜检测牛精子获能情况。一方面是精子获能时检测，在显微镜下可观察到精子非常活跃，尾部活动明显；另一方面是精子获能后检测，精子在获能后，头部曲线运动，尾部鞭打有力，幅度加大，表现为超激活运动。

3 牛卵母细胞体外受精技术

3.1 体外受精原理 体外受精是成熟牛卵母细胞与获能牛精子的结合过程，促使牛精子顺利进入牛卵母细胞，最终形成胚胎。受精的基本原理是人为创造牛体内受精条件，经过对精子的离心洗涤、上浮处理后，获取高质量精子，获能后与成熟卵母细胞共同放入受精液中，促进精卵相遇，完成原核发育。

3.2 精卵比例把控 牛卵母细胞体外受精采用微滴（包含10～15 个卵母细胞），微滴大小在50～200μL，精子浓度为0.64～1.0×106个/mL。在牛正常体内受精的情况下，精卵的比例一般是1～15:1，在体外授精的情况下，通过精卵比例的换算，确定精卵比例在10000～20000:1，所以采用了上述的卵母细胞个数与精子浓度。如果精子浓度过低，直接降低受精率，过高则会提升多精受精的概率，降低囊胚发育的质量。

3.3 精卵作用时间控制 体外受精选用的受精液不同，精卵作用的时间会有较大的差异，比如在BO液中大约是7 h 左右，在TALP 液中大约是19 h，少于16 h 会降低受精的质量。在体外受精研究中，有的人使用TALP 作为受精液，精卵作用5 h 后，提取出卵母细胞，然后放入早期培养液中，以此避免水解酶对受精卵的损伤，并且精卵共同孵育时间过长，会增加多精子受精量。所以在使用TALP 受精液时，孵育时间不可少于18 h，但不可超过24h。

3.4 体外受精操作方法 首先取出培养成熟的牛卵母细胞，放入受精液中洗涤4 次；其次平衡处理获能牛精子，制作成悬浮液微滴，精子浓度为0.8×106个/mL，接着在每个微滴上添加100 μL 卵母细胞液，保证每个精子微滴上有10～15 个卵母细胞；再次，将放有精卵微滴的培养皿放入培养箱中，培养箱中CO2浓度为5%，湿度为100%，温度为38℃，如果是BO 受精液培养时间6～8 h，TALP 受精液培养时间20～24 h。培养过程中使用显微镜观察受精卵的卵裂情况。在体外授精中需注意把握好精卵相遇的时间，最好是精子发生顶体反应时与卵子相遇，以确保精子顺利进入牛卵母细胞。牛卵母细胞体外受精还可直接采用显微镜进行操作，在显微镜下将精子注入牛卵母细胞中，直接完成受精，在精子数量有限的情况下适合采用该方法。

3.5 受精检测与判断 卵裂是判断牛卵母细胞体外受精是否成功的依据，牛卵母细胞在没有受精的情况下，卵母细胞的周隙很小，在受精后周隙增加，但有的老化卵也会出现该现象，需要继续培养，观察囊胚的发育情况。牛卵母细胞体外受精受到人为操作、培养环境与条件的影响，出现异常受精现象，常见的有多精受精、胚胎染色体异常等，应在受精阶段做好受精检测与判断，及时发现受精异常问题，以提高受精成功的概率。

3.6 体外受精注意事项

3.6.1 注意解决多精受精问题 在牛卵母细胞成熟判定中，主要的依据是原核发育情况，但原核成熟不是牛卵母细胞成熟判定的唯一标准，还需判断细胞质、透明带等的成熟情况，以此方可保证精卵之间的正常作用和变化，形成对多精的防御，避免多个精子在牛卵母细胞中生理变化。在体外受精过程中，可适当增加牛卵母细胞的培养时间，确保完全成熟，或严格控制受精时精子的密度，以及进行受精液中影响精子活力物质的调整，以降低多精受精的发生概率。

3.6.2 避免胚胎发育阻滞的发生 胚胎发育阻滞是体外受精面临的难点，一般好发生在胚胎发育早期，主要的原因是胚型基因激活滞后，导致胚型基因激活失败。为了避免发育阻滞的出现，在完成牛卵母细胞受精后，利用中间受体（兔或绵羊的输卵管）培养受精卵至囊胚阶段，然后再进行移植操作，也可采用“TCM199+血清”与体细胞（输卵管上皮细胞）培养受精卵，以及时有效的激活胚型基因。

4 结 语

牛卵母细胞体外受精是胚胎移植的前提，技术的应用关系到胚胎移植后的成长发育情况。所以通过对牛卵母细胞体外受精技术的深入分析研究，确定影响牛卵母细胞体外成熟培养的因素，进行牛卵母细胞采集、培养、受精等操作过程的优化调整，逐步完善牛卵母细胞体外受精技术体系，以避免牛卵母细胞、精子在体外受精操作过程中遭到损坏，提高受精率，以为牛繁殖领域输送更多基因优秀的胚胎。