kisspeptin抗骨质疏松症机制的研究进展

何佩真 李茂婷 于澜 林静 周广举

川北医学院附属医院内分泌科,四川 南充 637000

最近的一项荟萃分析显示,根据世界卫生组织的标准,全球骨质疏松和骨量减少患病率分别为19.7%(95%CI：18.0%～21.4%)和40.4%(95%CI：36.9%～43.8%),骨质疏松症在发展中国家的患病率(22.1%,95%CI：20.1%～24.1%)高于发达国家(14.5%,95%CI：11.5%～17.5%)[1]。随着全球人口老龄化的增加,这种疾病带来的全球经济和健康负担也日益加重。在过去30年中,对骨质疏松症发病机制的了解和治疗该病药物的开发都取得了显著进展。作为骨质疏松症的治疗手段,补充钙和维生素D是必须的,同时目前可选用的药物主要包括:雌激素、选择性雌激素受体调节剂(如雷洛昔芬)、降钙素、4种双膦酸盐(阿仑膦酸、利塞膦酸、伊班膦酸和唑来膦酸)、针对核因子-κB (nuclear factor,NF-κB)配体的受体激活的人单克隆抗体(地舒单抗)和甲状旁腺素类似物(特立帕肽)等[2]。但上述药物的不良反应不容忽视。研究表明雌激素有明显的不良反应,包括心脑血管事件、血栓栓塞事件和患乳腺癌风险的增加[3]。同样,对于选择性雌激素受体调节剂来说,尽管雷洛昔芬被批准用于骨质疏松症的同时可预防和治疗乳腺癌,但它增加了潮热和静脉血栓栓塞的发生率[4]。考虑到长期使用降钙素可能会增加患癌风险,且鉴于其作用机制,降钙素常导致低钙血症,低钙血症会引发手足抽搐、心脏停搏等不良事件,所以降钙素现在很少用于治疗骨质疏松症[5]。双膦酸盐是目前治疗骨质疏松症使用最广泛的药物,但限制其使用的主要问题是罕见的不良反应,如非典型股骨骨折和下颌骨坏死[6]。特立帕肽可能有患骨肉瘤的潜在风险[7]。虽然地舒单抗对不同年龄、不同肾功能情况,或有脆性骨折史的患者是安全的,但地舒单抗仍有可能诱发肌肉骨骼疼痛、低钙血症、下颌骨坏死等不良反应[8]。因此,考虑到除雌激素和雄激素以外的生殖激素对骨生理学的新兴作用,以及迫切需要开发新型、安全和有效的治疗药物来预防老龄人群的骨折。最新一些研究表明,kisspeptin可刺激成骨细胞分化以及抑制破骨细胞,因此其可能具有抗骨质疏松临床治疗潜力。本文就其发挥作用的可能分子机制综述如下。

1 kisspeptin与骨质疏松症

骨骼稳态受到骨重建过程的严密调控,保持最佳的骨量和强度,在骨重建过程中,破骨细胞的骨吸收和成骨细胞的骨形成之间的平衡维持着骨量,骨质疏松症是由骨吸收和骨形成之间的平衡紊乱造成的,这种平衡紊乱常见的原因之一是性激素的缺乏(主要是雌激素)[9]。因此,改善这种骨形成与骨吸收平衡紊乱是开发预防和治疗骨质疏松症的新型治疗药物的基石[10]。kisspeptin 是指位于染色体1(1q321q34)长臂上的cDNA上的KISS1基因编码的一类内源性肽,由145-氨基酸前体蛋白水解而来,在人体循环中已经鉴定出4个循环片段:kisspeptin-54,-14,-13和-10,这些片段共享 kisspeptin-54分子的 C 末端区域[11-12]。KISS1受体(KISS1 Receptor,KISS1R)是一种 G 蛋白偶联受体,kisspeptin-10与G蛋白偶联受体54(G-protein-coupled receptor 54,GPR54)结合[12],GPR54通过活化的 T 细胞c2(Nuclear factor of activated T-cells,NFATc2)和特异性蛋白1(specific protein,sp1)的核因子调节骨形态发生蛋白7(bone morphogenetic protein 7,BMP7)的表达,并在胚胎肾脏分支形态发生和肾小球发育中起重要作用[13]。kisspeptin 位于下丘脑-垂体-性腺轴的顶端,由下丘脑KISS1神经元分泌,其与KISS1R结合后激活促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone,GnRH)的释放,以脉冲方式将GnRH分泌到局部垂体-门静脉循环中。随后,GnRH负责刺激促性腺激素[黄体生成素(luteinizing hormone,LH)和卵泡刺激素(follicle stimulating hormone,FSH)]的生物合成和分泌,这些促性腺激素从脑垂体前叶系统循环到达性腺,以促进性类固醇[雌二醇(estradiol,E2)、睾酮(testosterone,T)和孕酮(progesterone,P)]的释放。研究已证实影响KISS1R (或 kisspeptin本身)的失活突变可导致人类和啮齿动物的中枢性性腺机能减退而导致生殖系统障碍[14-16]。KISS1基因对骨代谢的影响常通过已知的下丘脑-垂体-性腺轴发挥作用,如功能性下丘脑闭经的缺陷之一是 kisspeptin分泌减弱导致下游促卵泡激素和黄体生成激素分泌不足,无法维持正常的月经周期,最终导致雌激素缺乏和对骨骼动态平衡的不利影响[17]。但最近在小鼠中的数据表明,kisspeptin通过在小鼠成骨细胞上表达的 KISS1R可直接促进体外成骨细胞分化,这表明kisspeptin可能对骨骼稳态有直接的有益作用,且该作用独立于它对下丘脑-垂体-性腺轴刺激下游性类固醇水平升高而间接影响骨平衡的作用[18]。

2 kisspeptin抗骨质疏松的机制

2.1 刺激成骨细胞分化相关基因表达

成骨细胞主要由间充质干细胞分化而来,形成蛋白质性骨基质,并协调这种细胞外基质的矿化[19],分化受一系列激素和细胞因子的控制,成骨细胞表达各种表型标志物,如BMP、远端同源异构体5 (distal-less homeobox 5,Dlx5)、runt相关转录因子2 (runt-related transcription factor 2,Runx2)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)和骨钙素(osteocalcin,OC)[20-21]。最近的一项实验通过在BMP-2刺激下,整合素和钙粘蛋白协同工作使C2C12成肌细胞的成骨细胞谱系向骨细胞分化证实了BMP-2对成骨细胞组织分化至关重要[22],BMP2通过激活Smad蛋白1/5/9 (drosophila mothers against decapentaplegic protein1/5/9,Smad1/5/9)调节成骨细胞分化的早期阶段,如 Dlx5和 Runx2[23-24],这些因子也刺激下一阶段成骨过程中标志物的表达,包括ALP和OC[25]。

同时,先前的研究表明,在T细胞中被发现的NFAT转录复合体,包括5种亚型,分别为NFATc1、NFATc2、NFATc3、NFATc4和 NAFTc5[26],钙调磷酸酶/NFAT信号通路参与调节成骨细胞增殖、破骨细胞分化以及骨形成和骨吸收的协调[27]。

一项体外研究通过检测KISS1在3种骨肉瘤细胞系(MG-63、Saos-2和 U-2 OS)和正常成骨细胞系(hF-OB 1.19)中的表达水平观察到KISS1信使 RNA和蛋白质在正常成骨细胞系中的表达均高于3种骨肉瘤细胞系[28],表明KISS1可能通过加速细胞凋亡和自噬的过程,在体外抑制骨肉瘤的增殖[29]。在此前研究的基础上,另一项体外研究[18]证明了在小鼠间充质干细胞中,kisspeptin-10剂量依赖性地通过 GPR54/NFATc4信号级联调节BMP2表达和活化,随后通过BMP2诱导的Smad1/5/9磷酸化增加早期成骨标志物基因的表达,如Dlx5和 Runx2。相反,在KISS1R缺失细胞中,成骨细胞分化被抑制。除了BMP2外,kisspeptin信号传导还通过转录因子NFATc2和Sp1来调节BMP7的表达[13]。

最新的一项在26名健康男性[年龄(26.8±5.8)岁,体质量指数(23.8±2.3) kg/m2]中进行的随机、双盲、安慰剂对照的双向交叉研究中[30],每人参加2次研究访问,1次静脉内给予 kisspeptin[1 nmol/(kg·h)],1次静脉内给予安慰剂,从安静休息30～90 min,每30 min采集一次血样,结果证实了与安慰剂相比,kisspeptin在这个短期给药实验时间过程中引起总OC水平最大增加20.3%,且其中在骨重塑中占主导地位的羧化OC水平最大增加24.3%,研究者指出kisspeptin的这种给药方案引起循环kisspeptin水平显著增加,但下游FSH或T水平没有显著变化,证实了这种剂量下的 kisspeptin在体内的生物活性,且排除了这些下游性类固醇作为可能的混杂因素的变化。而此前的研究已经确定kisspeptin通过激活成骨细胞上的kisspeptin受体来诱导小鼠的成骨细胞分化,从而触发NFATc4介导的 BMP2表达和激活,也刺激下一阶段成骨过程中标志物如ALP的表达。这项最新的随机双盲对照研究同样也观察到kisspeptin可使人骨髓间充质干细胞的ALP水平提高41.1%。综上所述,这些数据证实了kisspeptin可直接在体外刺激增强成骨细胞的分化,并且在短期内增加健康男性骨合成代谢骨标志物OC、ALP,表明了其对人类的成骨作用。

2.2 抑制破骨细胞的骨吸收

破骨细胞是参与骨吸收的主要功能细胞。它们是单核巨噬细胞系统中的粒细胞-巨噬细胞集落,由单核细胞前体在骨髓基质细胞分泌的各种因子的作用下融合形成多核体,然后进一步分化成具有活性的破骨细胞[31]。最近的研究表明,破骨细胞可以在体内进行分裂,产生较小的细胞,称为“骨形态”,可以“再循环”与其他细胞融合,形成新的破骨细胞[32]。破骨细胞的分化主要受到核因子NF-kB配体(nuclear factor KB receptor activator ligand,RANKL)和巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor,MSCF)的受体激活剂的刺激[33]。研究表明,破骨细胞具有间歇性(形成圆形凹陷)或连续性(形成细长的沟槽)的骨吸收模式[34]。

在破骨细胞从CD14+单核细胞到成熟的破骨细胞的分化过程中,KISS1R信使RNA均可检测到,这表明KISS1信号不仅在成骨细胞上表达,在破骨细胞中同样起着作用[35],此前的研究通过每个骨表面侵蚀表面的百分比来评估破骨细胞活性[34]。在此基础上盲法计数受侵蚀的牛骨切片评估kisspeptin表现出对破骨细胞活性的抑制作用与在人类男性供体的破骨细胞中观察到的抑制作用是一致的,研究表明在最高剂量下(10 nmol kisspeptin)破骨细胞抑制率从29.6%(0.01 nmol kisspeptin)到48.1% (10 nmol kisspeptin)可于破骨细胞单核共培养物的显微镜下清楚地观察到抑制效果,与此相一致的是,该项研究同时考虑到破骨细胞/成骨细胞共培养物更能密切地代表体内骨重塑环境,从26.2% (0.1 nmol kisspeptin)到53.4% (10 nmol kisspeptin),这更加表明了kisspeptin的剂量依赖性抑制破骨细胞的作用[30],将其与使用标准的5 mg唑来膦酸治疗后预期的破骨细胞活性相比,两者对破骨细胞抑制水平相似[35]。但KISS1及其受体抑制破骨细胞活性与经典的RANKL及MSCF刺激破骨细胞分化通路的联系尚不清楚,还需进一步研究。

2.3 抑制雌激素受体α

破骨细胞及成骨细胞上均有雌激素受体α(estrogen receptor-α,ERα)表达,雌激素通过与ERα结合抑制破骨细胞的骨重吸收,促进成骨细胞的骨形成[36]。但另一方面,在内侧基底下丘脑(medial basal hypothalamus,MBH)内,ERα同样高度富集于两个解剖学和功能上不同的神经元簇,即弓状核(arcuate nucleus,ARC)和腹内侧下丘脑(ventroMedial hypothalamus,VMHv1)的腹侧区域,研究人员使用脑特异性的Nestin-Cre的小鼠模型去除ERα信号后小梁骨量的适度增加表明了中枢雌激素信号传导似乎对女性骨代谢产生负面影响[37-39]。

最近一项关键研究结合了不同的、针对中枢ERα的小鼠模型和立体定向手术,表明在小鼠下丘脑ARC中删除ERα信号可以导致骨量显著增加,且效果是性别特异性的(仅在雌性小鼠中发生),在Esr1Nkx2-1cre小鼠模型中,ERα 在包括ARC和VMHv1在内的男性和女性大脑的整个MBH中被有效地去除,年长雌性与对照同窝动物相比,小梁骨量和微架构显著增加,表现出股骨远端骨量增加约500%,骨量体积/组织体积从11%上升到52%。并且值得注意的是,在老年雌激素缺乏的女性ARC中选择性地去除ERα的骨表型可导致骨密度显著增加约50%,这表明循环雌激素或垂体激素水平升高不是这种性别依赖性骨表型的主要驱动因素,这同时提示绝经后骨量丢失的可能治疗途径[39]。研究人员将去除 KISS1细胞中的 ERα与上述骨表型对比,骨密度显著升高超过了所有年龄的雌性骨表型观察到的骨量,得出结论,特异性表达KISS1的下丘脑细胞中ERα的缺失触发强大的雌性高骨量表型是由于激活了ERα-脑-骨通路,通过抑制下丘脑kisspeptin神经元中的雌激素信号,促进小鼠的骨骼致密,这同时证实了kisspeptin对骨的作用独立于循环雌激素水平[40]。

3 总结与展望

kisspeptin独立于下丘脑-垂体-性腺轴在体外促进成骨细胞生成并有效抑制破骨细胞活性的能力使其有作为治疗骨质疏松症和相关骨疾病的新疗法的治疗潜力。越来越多的动物实验及临床研究表明,kisspeptin对骨骼产生的总体效应是有益的。但目前临床研究的一个局限性是参与者是健康的年轻男性,而骨质疏松症患者往往比目前临床研究中的患者年龄更大,因此可能成骨细胞活性及分化能力下降,另一局限性是给药时长较短,因此,还需要更进一步的临床研究来确定 kisspeptin 对不同年龄和骨质疏松症患者骨代谢的影响,以及研究更长时间的慢性给药对成骨细胞的影响且如何避免对下游性腺激素的影响,因为下丘脑-垂体-性腺轴激素本身之间复杂的相互关系使得在实验上很难分离它们。尽管明确的机制和途径数据仍有待完全确定和复制,但总的来说,kisspeptin抗骨质疏松症的临床应用前景还是令人期待的。