Livin和c-myc在子宫内膜异位症中的表达及临床意义

凌学民，黄建，骆慧芳，邓玲娜，周伟新

（深圳市龙岗区第二人民医院 1.妇科；2.病理科，广东 深圳 518000 ）

子宫内膜异位症是一种典型的妇科疾病，其经典定义是异位部位存在子宫内膜腺体和间质，主要是盆腔腹膜、卵巢和直肠阴道隔。它的症状包括痛经、性交困难、慢性骨盆疼痛、不规则子宫出血和/或不孕，对生殖和一般健康造成严重影响。这种疾病应被视为一个公共卫生问题，对妇女的生活质量有重大影响，同时也是一个巨大的经济负担。子宫内膜异位症影响肝脏和脂肪组织的新陈代谢，导致全身炎症，从而导致粘连、疤痕、内出血、肠道或泌尿功能障碍，并改变大脑中的基因表达，进而使患者出现疼痛敏感和情绪障碍［1］。该疾病的全部影响尚未得到充分认识，而且远远超出了骨盆［2］。了解其发病机制对于正确诊断和做出最有效的判断和治疗至关重要。尽管有许多有关这种病理的数据，关于子宫内膜异位症起源的统一机理仍然令人费解。众所周知，子宫内膜异位组织的发育和发展与雌激素关系密切。雌激素通过激活c-myc 和cyclin D1 等来参与细胞增殖。c-myc 作为一种原癌基因，可以通过激活细胞周期调节因子，具有深刻的促有丝分裂作用。它既可以激活或抑制基因表达，可促进细胞增殖。有研究指出，患有子宫内膜异位症的组织中检测到c-myc 表达有较大程度的增多［3］。不少研究指出，该病的形成可能与细胞的凋亡和增殖发生差错相关，其中凋亡抑制蛋白（IAPs）发挥了十分关键的作用，Livin 作为其中重要的一员被认为在抑制凋亡引起的细胞死亡以及调节细胞增殖和细胞周期中发挥作用，在癌症形成和/或进展过程中，有时会检测到异常的Livin 表达，据报道，Livin 在几种癌症类型中过表达，其中与恶性肿瘤和化疗耐药性相关，如肾上腺皮质肿瘤、前列腺癌、甲状腺乳头状癌等［4］。本实验主要为探究Livin 和c-myc 在子宫内膜异位症形成过程中的变化，为临床上该疾病的医治、预测预后和靶向基因治疗寻找新的生物学指标。

1 资料与方法

1.1 一般资料

采集2015 年1 月至2017 年12 月于深圳市龙岗区第二人民医院妇科就诊的72 名患者，将行开腹或接受腹腔镜手术后经病理学分析确诊为子宫内膜异位症的妇女为实验组（n=36），将子宫内膜正常的不育症患者选作对照组（n=36）。实验组年龄25～40 岁，平均（32.6±5.9）岁；对照组年龄25～43 岁，平均（30.2±6.3）岁。两组体重指数（BMI）均为正常水平（≤25 kg/m2）。所有参与者均承诺配合研究并签署知情协议。

实验组纳入标准：①都为绝经前妇女，经过病理学分析进一步确认为子宫内膜异位症；②在手术前3 个月内均未服用任何甾体激素类药物，至少3 个月没有服用避孕药；③患者未妊娠及哺乳，无全身疾病。排除标准：①妇科感染，全身炎症或自身免疫性疾病，以及用免疫抑制药物持续治疗；②患者存在内分泌失调相关疾病，或有肿瘤病史。

1.2 方法

采用免疫组化染色（SP 法）：Pipelle 抽吸刮匙从子宫体获得子宫内膜样本，并用冰冷的磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤几次以去除血液。同时，将子宫内膜和子宫内膜异位病变组织固定在10%的甲醛溶液中，然后嵌入石蜡中进行免疫组织化学染色。具体为将子宫内膜标本进行5 μm 厚连续切片，并置于恒温箱内，将温度设置为60℃并烘烤20 min，然后取出浸泡于二甲苯中20 min，然后使用无水酒精进行水化，并逐级降酒精浓度，每个浓度中各水化3～5 min，然后使用PBS 缓冲液洗涤标本3 次，共持续15 min，将其放置于浓度为0.01 mol/L 的枸橼酸缓冲溶液内并升温煮沸20 min，捞出让其自然冷却至室温并放置至少20 min 以完成抗原修复过程。使用PBS 缓冲液清洗标本3次，使用经PBS 稀释的正常羊血清在室温下封闭10～15 min，加入稀释到适当浓度的一抗置于4℃冰箱过夜，用PBS 洗涤三次后加入经1% FBS/PBS稀释到适当浓度的二抗，使其室温放置1 h，PBS缓冲液洗涤3 次后加入酶溶液，然后于37℃放置0.5 h，经PBS 清洗后加显色剂进行显色反应，待染色充分后用自来水终止显色，封片后进行镜检。

1.3 结果判定

将处理后样本进行免疫组织化学评估，通过镜检确定每个样本中的阳性染色细胞的百分数。在所有情况下，观察者对每个样本的一个切片中的1 000 个细胞进行了评估。当＜5% 的细胞呈阳性时，染色被视为阴性，以“-”表示。5%～25%（包括25%）为弱阳性，以“+”表示，25%～50%（包含50%）为中等强度阳性，以“++”表示，＞50%为强阳性，以“+++”表示，比较两组参与者子宫内膜Livin 和c-myc 的表达差异，同时观察子宫内膜异位症组织中Livin 与c-myc 表达水平之间的关系。

1.4 统计学方法

采用SPSS 19.0 软件进行数据分析。Livin 和c-myc 在子宫内膜异位症患者和健康人中的表达差异行χ2检验，子宫内膜异位症中Livin 和Pc-myc 表达的相互关系通过Spearman 秩相关性分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Livin 在两组子宫内膜中的表达差异比较

通过镜检结果发现，Livin 在实验组的阳性表达率为80.6%，明显高于对照组（22.2%），差异有统计学意义（χ2=24.519,P＜0.001），见表1。

表1 Livin 在两组子宫内膜中的表达差异比较（n=36）

2.2 c-myc 在两组子宫内膜中的表达差异比较

通过镜检结果发现，Livin 在实验组的阳性表达率为52.8%，明显超过对照组（0.0%），差异有统计学意义（χ2=22.255,P＜0.001），见表2。

表2 c-myc 在两组子宫内膜中的表达差异比较（n=36）

2.3 子宫内膜异位症中Livin 与c-myc 表达水平之间的关系

通过统计学分析表明，子宫内膜异位症中Livin 和c-myc 的表达水平之间具有显著正相关性（r=0.403,P=0.015），见表3。

表3 子宫内膜异位症组织中Livin、c-myc 表达的相关性（例）

3 讨论

子宫内膜异位症是一种和盆腔疼痛和不孕有关的疾病，几乎只发生在生殖年龄，目前临床医生和研究者对其病因和生理学了解甚少。尽管它普遍存在，但诊断通常会延迟数年，误诊很常见，有效治疗的时间也会延长。子宫内膜异位症诊断不足，从症状发作到最终诊断的平均潜伏期为6.7年，部分原因是需要手术诊断［5］。该疾病能使人衰弱，针对个体来说，会给其生活带来许多问题。准确的临床诊断能帮助医生对该病做出正确的识别和给予及时的帮助。与子宫内膜异位症相关的重大个人和公共健康问题强调了了解其发病机制和病理生理学对预防和开发敏感的非手术诊断分析和有效治疗的重要性。目前该病的相关机理并未明确，但关于月经逆行、间皮或腹膜化生以及存活子宫内膜细胞植入的理论已被广泛接受。最近的报告指出，子宫内膜异位症患者在位子宫内膜上皮的生存能力异常，可能致使其持续生长［3］。目前已有大量的探索发现细胞凋亡同该病的发病进程相关［6-7］。但关于其发病原因及机理的统一理论仍然令人费解。

Livin 是IAPs 家族的重要成员，IAP 是具有抗凋亡能力的蛋白质，与细胞凋亡和增殖关系密切。Livin 蛋白有两个重要的结构域，为具有锌结合环的BIR 的结构域和RING 结构域。BIR 是球状结构，是Livin 蛋白的重要组成成分，RING 结构域能够在其羧基末端协调两个锌原子。BIR 结构域是抑制活性所必需的，并与胱天蛋白酶或APAF1 反应，APAF1 与细胞色素C 一起介导胱天蛋白酶9的激活，而锌结合环结构域有时会提高抗凋亡活性，但不能单独抑制凋亡［4］。蛋白质-蛋白质相互作用网络表明，Livin 蛋白在凋亡过程、催化活性调节、酶抑制剂活性、JNK 级联和信号转导中具有重要功能。此外，Livin 还促进凋亡抑制剂拮抗剂的降解［4］。许多研究发现Livin 可以通过多种途径来抵抗细胞凋亡，其表达水平亦可能与预后不良有关［8-9］。LIU 等［10］应用免疫组化法研究Livin在不同卵巢子宫内膜异位组织中（癌组织，良性肿瘤和普通异位症组织）的表达差异。研究表明Livin 在癌组织中的表达水平较其他两组明显增多，表明Livin 表达水平的上调与癌变的出现有一定的联系。有研究指出［11］，发生子宫内膜异位症的女性内膜组织中的Livin 的表达水平明显超过正常内膜，当它附着于子宫外的细胞上可以使细胞异常增殖，导致异位造的出现。本研究结果显示，Livin 在子宫内膜异位症患者组织中的阳性表达率（80.6%）显著高于正常对照组（22.2%），表明Livin 的高水平表达可能与该病的发生息息相关，与文献报道［12］实验结果一致。

病灶粘连、肌动蛋白骨架调节、MAPK 和TGFβ/SMAD 信号通路可能是子宫内膜异位症发病机制的重要分子机制［13］。子宫内膜异位症的特征是在雌激素的调节下异位部位的子宫内膜组织生长，在包括人类乳腺癌细胞系在内的不同细胞类型中，雌二醇可上调与细胞增殖有关的几个基因，如c-myc。它在子宫内膜中的作用尚不清楚，一些研究结果表明，在子宫内膜异位症中，异位内膜以雌激素依赖的方式生长和退化。更重要的是，子宫内膜异位症患者的在位子宫内膜不仅含有雌二醇受体，还含有P450arom，这是一种催化雄激素转化为雌激素的酶，在该组织中引发雌激素微环境，可能通过内分泌途径起作用［3］。c-myc 作为与增殖相关的雌激素调节基因，是目前研究最广泛的原癌基因之一，它能编码细胞生长和分化所需的转录调节蛋白，可使细胞发生增殖或者凋亡。c-myc 能调整细胞增殖过程，在用有丝分裂原刺激细胞后，观察到c-myc 原癌基因表达的快速增加，并且c-myc 诱导足以将静止细胞驱动进入细胞周期。已经证明，c-myc 在子宫中被雌激素上调，其启动子含有非典型雌激素反应顺式作用元件［14］。近年来的许多实验研究也发现，c-myc 基因在腹膜子宫内膜中呈现出高表达状态［14］。本研究对正常子宫内膜和子宫内膜异位症样本中c-myc 的蛋白分布进行免疫组化分析。同种型匹配的抗兔抗体作为阴性对照，结果显示c-myc 在子宫内膜异位症组中呈高度表达状态，与研究结果［15-16］基本一致。

本研究结果同时显示，Livin 与c-myc 这两种分子参与了这些女性异位子宫内膜细胞增殖的调控，且它们之间存在正相关联系，提示二者之间可能以正反馈调节方式共同影响该病的发生发展。因此，对Livin 与c-myc 的联合检测在未来有机会作为子宫内膜异位症诊断的新指标，并有希望作为本病预防和治疗的新方向，但还需要进行更多的研究来探索这些分子之间复杂而严格的相互作用。