PARMS分子标记检测方法在番茄种质资源鉴定中的应用

石雪燕李涛王虹云张瑞清曹守军张丽莉姚建刚刘佳凤黄代峰

(1.山东烟台市农业科学研究院，山东 烟台 265599；2.烟台大学生命科学学院，山东 烟台 264005)

番茄(Solanum lycopersicum L.)果肉酸甜可口鲜嫩多汁，营养价值高，加工食用方法多样，深受人们喜欢，栽培地区广泛，是最具有经济效益的园艺作物之一。黄化曲叶病毒病是番茄的主要病害之一，被侵染后番茄叶片变小变厚变黄边缘卷曲，植株无法正常发育，以带有病毒的烟粉虱为主要媒介传播，由于烟粉虱繁殖能力强，防治困难，进而造成黄化曲叶病毒病发病加重[1]。番茄叶霉病是由病原体(Cladosporium fulvum)侵染造成的，叶片侵染后出现褐色的霉菌斑块[2]严重时番茄果实上会出现黑色的斑点导致果实硬化不能食用[3]。番茄颈腐根腐病是由尖孢镰孢菌番茄颈腐根腐病专化型(Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici，Forl)侵染引起的一种土传病害[4]，幼苗期从发病部位折倒而亡，5片叶后发病植株直立但是茎基部坏死，导致植株萎蔫死亡[5]。番茄极易受到病害影响导致产量和果实品质不佳，选育含有抗病基因的优良品种是最直接有效避免病害的方法。

五引物扩增受阻突变体系技术(PARMS)是在四引物扩增受阻突变体系(ARMS)的基础上开发出的通过荧光检测对SNPs或特定位点上的InDels进行精准的双等位基因判断[6，7]，在PARMS中，2种不同的通用引物被添加到引物的末端，通用荧光引物在扩增系统的参与下，将不同的基因型扩增以获得不同的荧光基团，检测样品仅通过PCR扩增一次，无需电泳检测，扩增数据通过荧光扫描仪直接从原始板中获得[8，9]。

本研究对番茄黄化曲叶病毒病抗病基因Ty-1、Ty-2、Ty-3，番茄叶霉病抗病基因Cf-9，番茄颈腐根腐病抗病基因Frl分别进行PARMS鉴定，以对PARMS检测方法在番茄育种材料中的应用进行综合评价。

1 实验材料及方法

1.1 实验材料

实验材料为山东省烟台市农业科学研究院蔬菜花卉所提供的134份番茄种质资源材料，见表1，种植在烟台农科院蔬菜基地，采集新鲜健康的番茄叶片液氮固定，-80℃保存以备后续实验。

表1 PARMS检测结果及田间鉴定

1.2 DNA的提取

使用的试剂为动物及多糖多酚双超mix试剂盒，购自北京聚合美科技有限公司(Mei5 Biotechnology Co.，Ltd)。取番茄叶片0.5cm2，加入加强型扩增最佳伴侣50μL充分研磨，沸水浴5min，12000rpm离心2min，得到番茄样品DNA模板，-20℃保存。

1.3 PARMS检测方法

反应体系为10μL：1μL DNA模板(50ng·μL-1)，5μL PARMS mix(2×)，0.45μL引物，3.55μL ddH2O。 PARMS-PCR扩增体系：94℃ 15min；94℃ 20s，65℃ 1min(-0.7℃/循环)，10个循环；94℃ 20s，57℃ 1min，35个循环；35℃ 1min。利用Applied BiosystemsTMQuantStudioTM6读取扩增产物的终点信号，使用其自带的软件进行分型分析。其中，连接FAM荧光标签序列的等位基因型聚合在X轴附近，连接HEX荧光标签序列的等位基因型聚合在Y轴附近，2种等位基因的杂合型在中间显示。由武汉景肽生物科技有限公司(Gentides Biotech Co.，Ltd)检测。

1.4 田间鉴定

134份种质资源材料分别于2020年、2021年、2022年春秋两季在田间进行种植，拉秧期对番茄黄化曲叶病、番茄叶霉病、番茄颈腐根腐病的发病情况进行调查。

2 结果及分析

对134份番茄材料进行PARMS检测，结果见图1。

注：横纵坐标值表示HEX与FAM荧光信号强度值；每1个圆点代表1份检测材料，蓝色代表抗性纯合材料，绿色代表没有抗性纯合材料，红色代表杂合材料，灰色代表游离在外无法判定，黑色代表没有扩增信号。

经检测含有Ty-1纯合基因的番茄材料43份，含有Ty-1杂合基因的番茄材料14份，不含Ty-1基因的番茄材料69份，未检出Ty-1基因的番茄材料8份；含有Ty-2纯合基因的番茄材料36份，含有Ty-2杂合基因的番茄材料2份，不含Ty-2基因的番茄材料90份，未检出Ty-2基因的番茄材料6份；不含Ty-3基因的番茄材料100份，未检出Ty-3基因的番茄材料34份。含有Cf-9纯合基因的番茄材料44份，含有Cf-9杂合基因的番茄材料19份，不含Cf-9基因的番茄材料59份，未检出Cf-9基因的番茄材料12份。含有Frl纯合基因的番茄材料50份，含有Frl杂合基因的番茄材料5份，不含Frl基因的番茄材料73份，未检出Frl基因的番茄材料6份。

结合田间鉴定及表1中PARMS检测结果发现，采用PARMS方法检测Ty-1抗病基因有8份材料未检出，分别是CH-20、CT-4、TY-26、TY-24、HY-2、SM-5、EP-7、ML-54；Ty-2抗病基因有6份材料未检出，分别是CH-5、CM-17、RS-12、FW-34、MS-85、SG-56；Ty-3有34份材料未检出，Ty-1和Ty-3为1对复等位基因，理论上只存在1个，携带Ty-1抗性为智利番茄LA1969来源，携带Ty-3抗性为智利番茄LA2779来源。根据田间鉴定结果表明，CT-4、TY-26、TY-24、HY-2、SM-5、EP-7为抗病材料，CH-20、ML-54为感病材料。综合田间调查及Ty分子标记检测，Ty-1标记与番茄Ty抗性有很大相关性。Cf-9抗病基因有12份材料未检出，分别是CL-11、CM-17、CS-22、PJ-2、CT-45、CM-33、SN-3、SN-78、SM-5、MK-43、ML-13、SD-6，根据田间鉴定结果显示，CS-22、CT-45、SN-3、SN-78、SM-5、MK-43抗叶霉病，CL-11、CM-17、PJ-2、CM-33、ML-13、SD-6为感病材料。Frl抗病基因有6份材料未检出，分别是CH-20、CS-21、TY-19、SG-43、JF-14、DF-56，根据田间鉴定结果显示，TY-19、SG-43、JF-14、DF-56为抗病材料，CH-20、CS-21为感病材料。

3 讨论

随着分子生物学在农学领域的大量应用，分子标记辅助育种成为一种有效的育种手段，与传统育种方式相比，分子育种便捷准确能缩短育种年限[10]，是当前的研究热点。与普通PCR技术相比，常规PCR成本较低，一般实验室内均可操作，但实验结果受操作方法影响大，检测步骤繁琐、效率低，无法快速完成大量的检测任务，使得大批量常规PCR检测受到限制[11]，而通过荧光检测的PARMS技术可进行批量检测，周期短、检测效率高，检测结果的准确率比常规PCR高[9，12]。

本研究利用PARMS分子标记检测技术，对134份番茄材料的5个抗病基因进行了检测，并通过田间调查对检测结果进行了验证。经综合评价，PARMS技术准确性为95%以上，检测效率高，适于大批量检测，可作为今后番茄育种材料抗病性检测的辅助手段。