生长抑素三硫化物的制备与质谱分析

王 军，邱荣英，成祥旭，李 涛，刘金明，田洪武，李铁健*，张贵民

（1．山东新时代药业有限公司，山东 临沂 273400；2．鲁南制药集团股份有限公司，山东 临沂 276005；3．国家手性制药工程技术研究中心，山东 临沂 276005；4．山东省手性制药技术创新中心，山东 临沂 276005）

生长抑素（结构如图1A）是由下丘脑分泌的一种肽类激素，是由9 种氨基酸组成的环状肽，主要作用于消化道、胰腺、中枢与外周神经系统，临床上用于治疗上消化道出血、急性胰腺炎、肝硬化合并出血等疾病［1-5］。最新研究表明，该药物对肿瘤也有一定治疗效果［6］。

目前大多数多肽药物通过固相合成技术获得，但在合成与存储过程中易形成杂质，包括氨基酸插入、氨基酸丢失、氧化/还原反应、多聚体杂质等，有些杂质不但没有疗效，反而具有毒副作用［7］。2023年2月国家食品药品监督管理局药品审评中心（CDE）发布了《化学合成多肽药物药学研究技术指导原则（试行）》（简称《原则》），为多肽类药物的质量研究提供了依据。该《原则》指出在外界因素下，肽类药物中的半胱氨酸（Cys）可能发生β-消除反应产生降解杂质，需进行深入研究［8］。有研究表明含有二硫键的蛋白类药物发生β-消除反应后，会进一步产生三硫化物杂质［9-10］。目前，生长抑素工艺杂质、异构体杂质与二聚体杂质均有报道［1，11-14］，而生长抑素三硫化物（理论结构如图1B）杂质国内外均未见报道。本研究首次对生长抑素三硫化物进行制备纯化并获得纯品，对其进行质谱分析，并确认了精确分子量、肽序列与三硫键连接位点，为生长抑素的质量研究提供了依据，对其他多肽类药物的三硫化物杂质研究也具有重要意义。

1 实验部分

1.1 材料与试剂

生长抑素（批号：504200601，鲁南新时代生物技术有限公司）；磷酸、磷酸二氢钠、磷酸二氢铵、乙酸、硫代硫酸钠与三乙胺均为分析纯，购自西陇科学股份有限公司；甲酸为质谱纯，购自TCI 公司；三（2-羧乙基）膦盐酸盐（TCEP·HCl）为分析纯，购自Thermo公司；乙腈为色谱纯，购自Merck 公司；制备级乙腈，购自潍坊中汇化工有限公司；超纯水为实验室自制。

1.2 仪器与设备

Waters Acquity H-Class 型超高效液相色谱系统（Waters 公司）；Synapt-XS 高分辨质谱仪（Waters 公司，配Masslynx V4．2 与Unifi Portal 软件）；Agilent 1260 HPLC液相色谱系统（美国Agilent公司）；NP7000-DAC50mm动态轴向压缩制备液相色谱系统（江苏汉邦科技有限公司）；FD8-3a 真空冷冻干燥机（GOLD-SIM 公司）；R-220 pro 旋转蒸发仪（BUCHI 公司）；XSR105DU/A 型电子天平（十万分之一，梅特勒公司）；WXTS3DU 型电子天平（百万分之一，梅特勒公司）。

1.3 HPLC色谱条件

色谱柱为AerisTMWIDEPORE XB-C18（4．6 mm×250 mm，3．6 μm）；流动相A 为1．1%磷酸水溶液（三乙胺调至pH 2．3），流动相B 为乙腈；梯度洗脱条件为：0～35 min，18%～40% B；35～36 min，40%～50% B；36～46 min，50% B；46～47 min，50%～18% B；47～55 min，18% B；流速为1．0 mL·min-1；柱温为40 ℃；进样量为5 μL； 检测波长为215 nm。

1.4 高压制备液相色谱条件

1.4.1 一次高压制备液相色谱条件色谱柱填料：Sepax GP C18（250 mm×50 mm，5 μm，孔径12 nm）；流动相A 为0．2 mol·L-1磷酸二氢铵溶液（用磷酸调至pH 2．2），流动相B 为乙腈；流速为50 mL·min-1；检测波长为215 nm。梯度洗脱条件为：0～40 min，20%～35% B；40～41 min，35%～60% B；41～45 min，60% B；45～46 min，60%～20% B；46～52 min，20% B。收集保留时间约为27 min的目标峰。

1.4.2 二次高压制备液相色谱条件色谱柱填料、流动相、流速及检测波长与“1．4．1”相同。梯度洗脱条件：0～40 min，30% B。收集保留时间约为18 min的目标峰。

1.4.3 三次高压制备液相色谱条件色谱柱填料：Sepax GP C18（250 mm×50 mm，5 μm，孔径12 nm）；流动相A 为0．2 mol·L-1乙酸水，流动相B 为乙腈；流速为50 mL·min-1；检测波长为215 nm。梯度洗脱条件为：0～15 min，8% B；15～16 min，8%～50% B；16～30 min，50% B；30～31 min，50%～8% B；31～40 min，8% B。收集保留时间约为21．5 min的目标峰。

1.5 液质联用（LC-MS）条件

色谱柱：Thermo Hypersil Gold AQ（2．1 mm×150 mm，1．9 μm），流动相A 为0．1%甲酸水溶液，流动相B 为乙腈。梯度洗脱条件为：0～3 min，5% B；3～9 min，5%～40% B；9～15 min，40% B；15～16 min，40%～5% B；16～20 min，5% B。柱温：40 ℃；流速：0．3 mL·min-1；进样量：1 μL（还原前供试品溶液）或10 μL（还原后供试品溶液）；检测波长为215 nm。

离子源：电喷雾电离（ESI）；扫描模式：正模式；扫描范围：m/z25～2 000；雾化气流速：800 L·h-1；离子源温度：100 ℃；毛细管电压：2．5 kV；锥孔电压：40 V；碰撞能量：30～60 eV。

1.6 溶液制备

1.6.1 生长抑素三硫化物粗品溶液制备取适量生长抑素溶于水中，加入Na2S2O3，生长抑素与Na2S2O3的摩尔比为1∶2，60 ℃水浴反应1 h后备用。

1.6.2 质谱分析样品溶液配制还原前供试品溶液：冻干后样品经水溶解，配制成质量浓度约为1．0 mg·mL-1的溶液。该溶液用于目标物精确分子量的测定。

还原后供试品溶液：量取上述还原前供试品溶液10 μL，加入80 μL 水和10 μL 0．1 mol·L-1TCEP·HCl溶液，混匀后室温下反应5 min，用于目标物肽序列与三硫键连接位点的测定。

2 结果与讨论

2.1 生长抑素三硫化物粗品的合成

文献报道，使用硫化氢气体［15］或硫代硫酸盐［16］与蛋白质类药物反应可生成三硫化物。由于硫化氢气体有毒性且易燃易爆，不易操作，从安全角度出发，本研究首先加入硫化钠与生长抑素反应，未获得目标物。然后改用Na2S2O3与生长抑素反应，发现生长抑素与Na2S2O3的摩尔比为1∶2，60 ℃水浴反应1 h 后可获得生长抑素三硫化物，经HPLC 检测目标物的纯度约为10%，能够满足后期的制备纯化要求。

2.2 生长抑素三硫化物的纯化

目前检测生长抑素三硫化物的HPLC 方法中流动相A 含有三乙胺，会与色谱柱填料中的硅醇基结合，对色谱柱填料产生不易逆转的影响，导致柱效下降，因此未采用其作为高压制备液相色谱的流动相。本研究采用pH 2．2 的磷酸二氢铵溶液作为流动相A，乙腈作为流动相B，经优化梯度，第一次制备纯化的色谱图见图2A，可将生长抑素三硫化物（图中保留时间为27．1 min 的峰）与其他干扰物分开。然后对该目标物进行收集与浓缩，HPLC 检测其纯度大于70%，作为二次制备纯化的供试品溶液。第二次制备纯化采用等度洗脱方法，其色谱图见图2B，对保留时间约为18．0 min 的峰进行收集浓缩，HPLC 检测其纯度大于95%，作为三次制备纯化的供试品溶液。第三次制备纯化采用易挥发的乙酸水作为流动相A，乙腈作为流动相B，优化梯度后，对目标化合物进行收集浓缩，即可将二次制备样品中的磷酸盐转为乙酸，而乙酸在浓缩与冻干步骤中可挥发去除，因此不影响下一步的质谱分析。经过冻干后，HPLC 检测其纯度大于95%，其色谱图见图3。

图2 生长抑素三硫化物的一次制备（A）与二次制备（B）色谱图Fig．2 The first preparation（A） and second preparation（B） chromatograms of somatostatin trisulfide

图3 生长抑素三硫化物冻干后的色谱图Fig．3 Chromatogram of somatostatin trisulfide after freeze-dried

2.3 生长抑素三硫化物的质谱分析

多肽分子由于分子量较大，通过紫外光谱、红外光谱、核磁共振波谱等进行结构解析存在困难［8］，目前多采用LC-MS 法进行分析［17-18］。本研究采用LC-MS 法对生长抑素三硫化物的精确分子量、肽序列与三硫键连接位点进行了分析，具体结果如下。

2.3.1 精确分子量的测定由图1 可知，生长抑素三硫化物的分子式为C76H104N18O19S3，精确的单同位素分子量为1 668．688 7。还原前供试品溶液的一级质谱图见图4，其加合离子［M+2H］2+的质荷比（m/z）为835．353 9、［M+3H］3+的m/z为557．236 9，与生长抑素三硫化物理论计算值（［M+2H］2+的m/z为835．351 6、［M+3H］3+的m/z为557．236 9）的质量误差均小于10×10-6，表明与目标物的理论分子量相符。

图4 生长抑素三硫化物的一级质谱图Fig．4 MS spectrum of somatostatin trisulfide

2.3.2 肽序列分析多肽药物离子化后进入质谱质量分析器和离子碰撞池，施加适当的电压和碰撞气体后，其骨架发生断裂，在ESI 源下诱导碰撞解离（CID）后形成一系列b 离子和y 离子，再通过软件进行拼接，可得到肽段的序列［19-20］。在CID 下，一般优先引起肽骨架断裂，但不会导致二硫键断裂［21］，目前常用还原剂对二硫键还原后再进行测序［22］。有报道显示抗体药物中的三硫键在TCEP 还原下，可生成二硫键与游离巯基，其机理见图5［23］。因此，本研究使用TCEP 对生长抑素三硫化物还原后再进行肽序列测定。

图5 三硫化物与TCEP还原反应机理Fig．5 The mechanism of trisulfide reduction with TCEP

还原后供试品溶液经质谱分析的总离子流图（TIC）如图6 所示，主要生成了化合物1（保留时间为9．74 min）与化合物2（保留时间为9．52 min）。

图6 生长抑素三硫化物还原后的总离子流图Fig．6 Total ion chromatogram of reduced somatostatin trisulfide

其中化合物1 的质谱图见图7A，其加合离子［M+2H］2+的m/z为819．367 0、［M+3H］3+的m/z为546．579 1，均与生长抑素的理论计算值（［M+2H］2+819．365 6、［M+3H］3+546．579 5）吻合，质量误差小于10×10-6。化合物2 的质谱图见图7B，其加合离子［M+2H］2+的m/z为820．375 4、［M+3H］3+的m/z为547．251 6，与生长抑素相比，该化合物的相对分子质量增加2 Da，可初步判断为生长抑素线性肽（C76H106N18O19S2），质量误差小于10×10-6。结合图5 所示反应机理，初步判断生长抑素三硫化物与TCEP反应后生成了生长抑素（化合物1）与生长抑素线性肽（化合物2）。其中生长抑素线性肽可用于肽序列的测定，经检索后的匹配图见图8，具体b/y 离子匹配表见表1，表中加粗部分为匹配上的离子，匹配度较高，可知样品序列为：A-G-C-K-N-F-F-W-K-T-F-T-S-C，与生长抑素三硫化物的理论肽序列信息相符。

表1 生长抑素三硫化物（还原后）肽序列匹配表Table 1 Peptide sequence matching table of reduced somatostatin trisulfide

图7 化合物1（A）与化合物2（B）的一级质谱图Fig．7 MS spectra of compound 1（A） and compound 2（B）

图 8 生长抑素三硫化物（还原后）的肽序列匹配图Fig．8 Peptide sequence matching map of reduced somatostatin trisulfide

2.3.3 三硫键连接位点确认目前关于二硫键的鉴定方法报道较多，包括柱后在线还原法［24］、离子源内部分还原法［25］、化学裂解法［26-27］与溶液中的试剂还原法［28］，而三硫键的鉴定多集中在抗体类药物［15，23，29］，多肽类药物中的三硫键定位未见报道。本研究建立了多肽类药物中三硫键的定位方法。通过优化TCEP 与生长抑素三硫化物的反应时间，发现在室温下反应5 min，可将其还原为生长抑素与生长抑素线性肽。与上述文献方法相比，本方法反应时间短，无需烷基化且易于操作。通过“2．3．2”的肽序列可知，该结构中存在2 个半胱氨酸，理论上只存在1 对三硫键。生长抑素三硫化物与生长抑素线性肽序列的结构如图9 所示，由于三硫键在CID下不易碎裂，因此生长抑素三硫化物理论上不会产生y9、y10、y11等碎片离子，而通过比较二者特征离子y12的质量差可判断三硫键连接位点。经检测，生长抑素三硫化物的y12离子m/z为1 541．649 0，生长抑素线性肽的y12离子m/z为1 511．684 5，前者比后者多30 Da，由此确证三硫键连接位点为Cys（3）-Cys（14），与生长抑素三硫化物的理论结构相符。

图9 生长抑素三硫化物（A）与生长抑素线性肽（B）的结构Fig．9 The structures of somatostatin trisulfide（A） and somatostatin linear peptide（B）

3 结 论

本研究将生长抑素与Na2S2O3以摩尔比1∶2 在60 ℃水浴下反应1 h后，制得的生长抑素三硫化物的纯度约10%，此反应液经3次制备纯化后冻干，获得了纯度大于95%的目标物。经过质谱分析，其精确分子量、肽序列与三硫键连接位点均与理论结构一致。目前未见该化合物的相关报道，该研究为进一步开展生长抑素的质量研究提供了参考，对其他多肽类药物的三硫化物杂质研究也具有重要意义。