氮掺杂碳纳米管增强中空纤维液相微萃取-高效液相色谱法测定生物样本中溴系阻燃剂

马琳琳，张泽霖，清江，孟桃于，焦叶，陈茂龙，文 李，程云辉，丁 利*

（1．长沙理工大学 食品科学与生物工程学院，湖南 长沙 410114；2．上海海关工业品与原材料检测中心，上海200135；3．长沙和合医学实验室有限公司，湖南 长沙 410000）

溴系阻燃剂（BFRs）是全球应用最广泛的阻燃剂之一，常被添加到纺织品、塑料制品和电子产品中［1-2］。据不完全统计，BFRs 在有机阻燃剂市场的占比达35%。其中四溴双酚A（TBBPA）和十溴二苯醚（BDE209）是使用最广泛的两种溴系阻燃剂（结构式见图1），其使用量占据了全球溴系阻燃剂市场的60%。近年来，TBBPA 和BDE209对人体健康的影响备受关注。美国国家毒理学计划的研究显示TBBPA 具有神经毒性［3］和急性毒性［4］，它可通过血液直接接触免疫细胞，引起潜在的免疫毒性［5］。此外，TBBPA 是一种潜在的内分泌干扰物，会导致内分泌系统和神经功能紊乱［6-7］，已经被国际癌症研究中心列为2A致癌物［8］。BDE209 具有环境持久性、远距离迁移、生物累积性等［9］，在2017 年《斯德哥尔摩公约》中被列为新的持久性有机污染物（Persistent organic pollutants，POPs），欧盟也于2008 年正式将其在电子电器产品中的限量设定为1 000 mg/L。目前，在灰尘［10］、废水［11］、水生生物［12］、污泥［13］和土壤［14］中均检出TBBPA 和BDE209，其均可能通过食物链进入人体内不断累积和放大，最终对人类健康产生危害。傅家谟及其团队［15］测定了广州某医院血清样品中的多溴联苯醚，其含量为1．5～17 ng/g；张圣虎等［16］对人体尿液中TBBPA进行检测，含量在0．03～0．173 μg/L之间。因此，测定人体生物样本中TBBPA和BDE209的含量对人体健康监测具有重要意义。

图1 四溴双酚A（A）和十溴二苯醚（B）的结构式Fig．1 Structural formulas of TBBPA（A） and BDE209（B）

目前，主要检测的溴系阻燃剂有TBBPA、多溴二苯醚和六溴环十二烷等，测定对象主要为塑料制品、纺织制品、环境基质等，常用的检测方法包括液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）［15］、气相色谱-串联质谱法（GC-MS/MS）［16-17］和高效液相色谱法（HPLC）［11］。基于生物样本基质复杂和污染物含量较低的特点，样品前处理在其检测环节中至关重要。Bergant等［18］采用甲酸沉淀血清中蛋白质，异辛烷液液萃取的方式，建立了测定血清中多溴联苯醚（包括BDE209 在内的38 种同系物）的GC-MS 法。Hayama等［19］利用甲醇沉淀血清中蛋白质，离心样本通过固相萃取小柱，结合LC-MS/MS 法测定人血清中TBBPA。Lee等［20］采用新型QuEChERS法萃取富集血清中BDE209，血清样本采用1 mL 乙酸乙酯-己烷-丙酮混合液提取，无水MgSO4和NaCl 盐析后，提取液经含PSA 的离心管净化，氮吹干后，40 μL 异辛烷复溶并注入GC-MS/MS 进行分析。在液液萃取以及固相萃取等前处理方法中，均需先沉淀蛋白质，步骤繁琐，有机溶剂消耗较大。中空纤维液相微萃取（HF-LPME）是集采样、萃取、富集于一体的新型前处理方法。相较于传统方法，HF-LPME 只需使用微量的有机溶剂即可获得高的富集倍数（EF）［21］，且中空纤维膜壁孔径在0．0925～0．2457 μm之间［22］，能有效排阻样品中的大分子物质［23］。为了进一步提高HF-LPME 的萃取富集能力，加入不同功能化的纳米材料［24］，通过协同萃取作用提高对目标分析物的萃取效率。例如Darvishnejad 等［25］制备了MIL-101（Cr）@氧化石墨烯复合材料用于增强HF-LPME 萃取，建立了番茄、黄瓜和农业用水中二嗪磷和毒死蜱残留量的测定方法。Sun 等［26］通过石墨烯增强HF-LPME，用于牛奶中苯基脲类除草剂的检测。氮掺杂碳纳米管（N-CNTs）是基于碳纳米管掺杂N 原子，增加了表面缺陷和反应位点，使其具有更大的比表面积和特定官能团［27］。由于π-π堆叠作用，NCNTs 容易萃取含苯环化合物。Han 等［28］使用N-CNTs 增强HF-LPME 富集番茄中的两种植物生长激素，富集效果优异。因此，利用N-CNTs 的增强吸附能力和中空纤维的大分子排阻能力，简化了血清和尿液中TBBPA和BDE209的前处理步骤，对提高检测灵敏度具有一定的研究意义。

本研究以血清和尿液中TBBPA 和BDE209为研究对象，采用N-CNTs增强HF-LPME（N-CNTs-HFLPME），建立了血清和尿液中溴系阻燃剂的高效萃取富集及同时一步去除蛋白的方法（图2），并通过结合HPLC法，实现了血清和尿液中TBBPA和BDE209的同时检测。

图2 N-CNTs-HF-LPME 分析生物样品中溴系阻燃剂的示意图Fig．2 Schematic of analysis for brominated flame retardants in biological samples by N-CNTs-HF-LPME

1 实验部分

1.1 仪器、材料与试剂

Waters 2695 高效液相色谱仪（美国Waters公司），配备紫外检测器及色谱工作站；KQ5200B 超声波振荡器（昆山超声仪器有限公司）；AX224ZH 分析天平（感量：0．000 1 g，常州 OHAUS 公司）；扫描电子显微镜（SEM，FEI Co． Hillsboro，OR，USA）检查材料的形态；1．0 mL微量注射器（型号702SNR，江西锦胜医疗器械集团有限公司）。

正己烷、正辛醇、甲苯、乙酸乙酯、氯化钠（NaCl）均为分析纯，购自国药化学试剂有限公司（北京）；乙腈（色谱纯，美国天地有限公司）；溴系阻燃剂标准品：TBBPA（纯度 98% ）、BDE209（纯度 ＞95% ）均购于麦克林（上海）；聚丙烯中空纤维膜（内径为0．6 mm，壁厚为0．2 mm，壁孔径为0．45 μm）由Membrana（德国伍珀塔尔）提供。Milli-Q超纯水（18．2 MΩ．cm， Millipore公司），实验用水均为超纯水。

1.2 标准溶液的配制

准确称取TBBPA和BDE209各100 mg，分别用甲醇和甲苯配制成单个标准储备溶液（1 mg/mL）。然后分别移取1．0 mL 单标准储备溶液于100 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成10 mg/L 混合标准溶液，于4 ℃冷藏避光保存。使用时用甲醇稀释成合适质量浓度的标准溶液。

1.3 N-CNTs增强中空纤维（N-CNTs-HF）的制备

N-CNTs-HF 的制备参考文献［28］：将十六烷基三甲基溴化铵（0．068 g， CTAB）超声溶解在20 mL 水中，再将N-CNT-HF（0．06 g）加入到上述溶液中超声处理30 min，在4 000 r/min 下离心1 h，以确保NCNTs-HF 分散均匀。将HF 膜切成约3 cm，转移至N-CNTs-HF 的水分散体中，超声处理3 h 后，用水清洗N-CNTs-HF的表面和内腔，在70 ℃真空干燥2 h后，备用。

1.4 血清和尿液样品预处理

血清样品收集自湖南省人民医院（中国长沙）的志愿者。尿液样本来自长沙理工大学的志愿者，所有样本均保存在-4 ℃。用水将样本稀释10倍，再用0．1 mmol/L盐酸溶液将样品溶液调至pH 7．0，最终体积为7 mL，置于血清瓶中。

1.5 N-CNTs-HF-LPME 前处理

将N-CNTs-HF 膜浸渍在选取的萃取溶剂中10 min，使萃取溶剂完全浸入纤维孔中。然后用微量取样器将15 μL 萃取溶剂从HF 膜的一端注入管腔，两端热封。将封闭后的N-CNTs-HF 膜放置于装有预处理后的生物样本的血清瓶中，在磁力搅拌器上按照固定的转速提取10 min。完成提取后，将HF膜剪成三段置于离心管中，加入乙腈超声解析。最后，将所得溶液通过0．22 μm 有机滤膜过滤，进行HPLC-UV分析。

1.6 HPLC条件

色谱柱：Kjnetex EVO C18（2．1 mm × 150 mm，5 μm）；柱温为30 ℃；进样量：10 μL；紫外检测波长：235 nm；流动相A：水，流动相B：乙腈；流速：0．3 mL/min；梯度洗脱程序为：0～3．0 min，30%～60% A；3．1～4．0 min，60%～30% A；4．1～5．0 min，30% A。

2 结果与讨论

2.1 HF和N-CNTs-HF的表征

图3A 是HF 和N-CNTs-HF 的照片，可以看出其外观由白色变为黑色，表明中空纤维上成功掺杂N-CNTs。图3B为HF的SEM 图，可以看到HF的壁上有很多孔隙，这为容纳材料提供了空间。图3C中可观察到N-CNTs的规则条状和10～30 μm范围内的长度。图3D显示在HF的孔中可以观察到条形的NCNTs，表明成功制备了N-CNTs-HF。

图3 原始HF（左）和N- CNTs-HF（右）的物理视图（A）；原始HF（B）、N-CNTs（C）及N-CNTs-HF（D）的SEM图Fig．3 Physical views of original HF（left） and original N-CNTs-HF（right）（A）；SEM images of original HF（B），N-CNTs（C） and N-CNTs-HF（D）

2.2 N-CNTs-HF-LPME 的优化

对影响萃取效率的参数，包括萃取溶剂的类型、样品pH 值、NaCl 浓度、萃取时间、搅拌速度和解吸溶剂的种类进行以下优化，并使用萃取效率进行量化。

2.2.1 萃取溶剂的优化HF-LPME 的本质是基于相似相溶原理，萃取溶剂的组成会显著影响HFLPME［29］的萃取效率。根据TBBPA和BDE209的化学性质，选取乙酸乙酯、甲苯、正己烷和正辛醇作为萃取溶剂进行优化。尿液样本的提取结果如图4A 所示。BDE209 的最佳萃取溶剂为甲苯，萃取效率接近80%。TBBPA 的最佳萃取溶剂为正辛醇，萃取效率约为85%。为同时优化BDE209 和TBBPA 的富集效率，考察了不同比例（1∶4、2∶3、3∶2、4∶1、1∶1）甲苯-正辛醇溶液的影响。结果显示，甲苯-正辛醇（1∶1）的萃取效率最高，BDE209和TBBPA的萃取效率均在90%以上（图4B）。因此，实验选择甲苯-正辛醇（1∶1）作为尿液样品的最佳萃取溶剂。

图4 萃取溶剂类型（A）及甲苯-正辛醇比例（B）对尿液中两种溴系阻燃剂富集的影响Fig．4 Effects of extraction solvent type（A） and ratio of toluene to octyl alcohol（B） on the enrichment of two brominated flame retardants in urine

采用同样方法考察了萃取溶剂对血清样本中BDE209和TBBPA 萃取效率的影响，结果显示，以乙酸乙酯为萃取溶剂时，TBBPA 的富集因子最高，而BDE209的萃取效率小于40%。以甲苯为萃取溶剂时，BDE209 的萃取效率高达80%，然而TBBPA 的萃取效率在35%左右。为获得两种分析物的最佳萃取效率，考察了不同比例（1∶4、2∶3、3∶2、4∶1、1∶1）甲苯-乙酸乙酯溶液的影响。结果显示，甲苯-乙酸乙酯（1∶1）显示出最佳的萃取效率，两种溴系阻燃剂的萃取效率均大于90%。因此，实验选择甲苯-乙酸乙酯（1∶1）作血清样品的萃取溶剂。

2.2.2 N-CNTs 浓度的优化增加掺杂材料的用量通常会提高对目标物的吸附，但材料过多可能会堵塞HF 的孔隙。因此，本研究对NCNTs 的浓度进行了优化。结果显示，N-CNTs浓度在0～3 mg/mL 之间时，通过N-CNTs 和HF的协同萃取作用，TBBPA 和BDE209 的萃取效率随着N-CNTs 浓度的增加而增加。当NCNTs 的浓度从3 mg/mL 增至5 mg/mL 时，目标物的萃取效率反而下降，这可能是由于NCNTs浓度过高时易形成大块物质，堵塞HF 微孔膜，不利于化合物的传质作用，从而降低有机溶剂的萃取效率。因此，实验选择3 mg/mL N-CNTs作为化合物提取的最佳浓度。

2.2.3 NaCl 浓度的优化考察了不同NaCl浓度（0、5%、10%、15%、20%）对萃取效率的影响［30］。尿液提取结果显示，目标物的萃取效率在NaCl添加量为10%时最佳。然而，随着血清中NaCl的加入，目标物的萃取效率逐渐降低，这种现象可能是由于血清本身含有蛋白质、激素等内源性物质，粘度较高；盐离子的加入增加了溶液的离子强度，导致溶液的粘度进一步增加，从而影响了目标物向萃取溶剂的传质，降低了萃取容量和扩散系数。因此，后续实验选择在尿样中加入10% NaCl，在血清中不加入NaCl。

2.2.4 搅拌速度的优化考察了0～1 000 r/min的搅拌速率对TBBPA和BDE209萃取效率的影响。结果显示，随着搅拌速率的增加，萃取效率先增大后减小，搅拌速率为200 r/min 时对尿液的富集效果最好。血清中的萃取效率在转速为600 r/min 时最高，可能是因为血清中粘度较高，需较大转速促进目标物的转移。但转速过高时，剧烈搅拌下可能在HF膜中形成气泡，阻碍了分析物的进入，同时萃取剂也发生损失，从而导致萃取效率降低。因此，尿液和血清样本分别选择200 r/min和600 r/min为最佳搅拌速率。

2.2.5 提取时间的优化目标分析物在样品溶液和萃取溶剂之间的转移是一个动态平衡过程，需要一定的时间达到平衡，以获得最大的萃取效率［31］。本实验优化了不同提取时间（5～60 min）对两种待测溴系阻燃剂的影响。结果显示，提取效率在0～10 min 时逐渐增加，10 min 后达到提取平衡。当提取时间超过10 min 时，萃取效率开始降低，可能是由于提取时间较长导致有机溶剂挥发所致。因此，选择最佳提取时间为10 min。

2.2.6 pH值的优化样品溶液的pH值会影响目标分析物的电离形式，从而影响萃取效率［28］。本文研究了样品pH 值在3．0～9．0 范围内的影响。如图5A 所示，当pH 值从3．0 增加到7．0 时，TBBPA 的萃取效率稍微增加。当pH 值从7．0 增加到11．0 时，萃取效率降低。此结果归因于TBBPA 在pH 值大于8．0开始去质子化［32］，以离子形式存在，不利于吸附。对于BDE209，pH 值在3．0～9．0 的较宽范围内，萃取效率超过120%，pH 值为9．0～11．0 时略有下降（图5B）。这可能是由于BDE-209 在pH 值3．0～11．0 范围内较为稳定。因此，实验选择最佳pH值为7．0。

图5 pH值对尿液（A）和血清（B）中两种溴系阻燃剂富集的影响Fig．5 Effects of pH values on the enrichment of two brominated flame retardants in urine（A） and serum（B）

2.2.7 解吸溶剂的优化被吸附在N-CNTs-HF 中的分析物经萃取后需采用有机溶剂超声解吸。实验考察了乙腈和甲醇作为解吸溶剂时对尿液和血清中TBBPA 和BDE209 的萃取效率。结果显示，使用乙腈解吸时，尿液和血清中TBBPA 和BDE209 的萃取效率均大于80%。采用甲醇时，TBBPA 的解吸效率较低，萃取效率小于50%。因此，实验选择乙腈作为最佳解吸溶剂。

为了证明增强HF-LPME 的富集效果，基于上述优化结果，将沉淀蛋白后的血清样本与经N-CNTs-HF-LPME 处理后的样本进行比较。结果显示，经增强中空纤维膜前处理后，TBBPA 和BDE209 得到明显有效的富集，且二者的出峰位置处无其他物质干扰（见图6）。

图6 200 ng/L BFRs经N-CNTs-HF-LPME 处理前（a）后（b）的色谱图Fig．6 Chromatograms of 200 ng/L BFRs before（a） and after（b） treatment with N-CNTs-HF-LPME

2.3 方法确证

在优化条件下，采用N-CNTs-HF-LPME结合HPLC 对两种溴系阻燃剂的系列质量浓度标准样品进行检测。结果显示，TBBPA 和BDE209 分别在2～200 ng/mL 和10～200 ng/mL范围内具有良好的线性关系，相关系数（r2）分别为0．999 和0．995。TBBPA 和BDE209 的检出限（LOD）分别为0．375 ng/mL 和2．8 ng/mL，定量下限（LOQ）分别为9．4 ng/mL 和1．25 ng/mL。为验证方法的准确性和重复性，在空白生物样品中，加入适量标准溶液进行3个水平的加标回收实验，每个水平进行5次重复，连续3 d，结果见表1。两种目标分析物的平均加标回收率为84．5%～114%。BDE209 和TBBPA 的日内和日间相对标准偏差（RSD）为1．4%～7．5%，符合方法学要求。实验结果表明方法具有较高的准确性和重复性。

表1 血清和尿液中两种目标分析物的回收率及相对标准偏差Table 1 Recoveries and RSDs of two target analytes in serum and urine

2.4 N-CNTs-HF的重复性

为了验证N-CNTs-HF 的批次制备重复性，对实验中分批次制备的N-CNTs-HF 进行称量，质量均在（3．0±0．1） mg，且在实验应用中的萃取效率均大于80%（见图7）。表明N-CNTs-HF 的批次制备重复性良好。

图7 分批次制备的N-CNTs-HF的质量以及对BDE209和TBBPA的萃取效率Fig．7 Mass of N-CNTs-HF prepared in batches and extraction efficiencies of BDE209 and TBBPA

2.5 与其他前处理方法的比较

本文与其他文献报道的样品前处理技术进行比较，结果如表2所示。本方法的前处理仅需10 min，且在富集目标物的同时可一步去除蛋白，有机溶剂使用量低。该方法高效快速，但与质谱法相比检出限略高。

表2 本方法与已报道的BFRs检测方法的比较Table 2 Comparison of the established method with the reported methods for detection of BFRs

2.6 实际样品分析

根据建立的方法对实际样品进行分析，血清实际样本共有50 份，其中5～20 岁的血清样品2 份、20～30 岁的血清样品38 份、30～40 岁的血清样品10份；尿液样本8 份，年龄在20～30 岁之间。所分析的样本均未检出TBBPA 和BDE209，图8 为实际样本和加标样本的色谱图。

图8 生物样品及加标生物样品（200 ng/mL）的色谱图Fig．8 Chromatograms of a biological sample and the sample spiked with 200 ng/mL of analytes

3 结 论

本文建立了N-CNTs-HF-LPME-HPLC 检测生物样品中溴系阻燃剂的分析方法。该方法使用NCNTs 修饰HF，通过固相协同作用增强了对TBBPA和BDE209的萃取效率；同时利用HF在萃取目标物的同时进行了蛋白质排阻，简化了前处理步骤，缩短了分析时间。与传统方法相比，该方法准确快速，灵敏度高，使用有机溶剂少，绿色环保，适用于复杂基质中TBBPA和BDE209的检测，可为N-CNTs-HF-LPME 在生物样品中持久性有机污染物的分析提供参考。