肠道菌群变化情况与急性胰腺炎易位感染的相关性

郭海阁

(商丘市中心医院 检验科,河南 商丘 476000)

急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)是消化内科常见疾病,20%～30%的AP患者会发展为重症AP,增加预后风险[1]。随着重症支持治疗技术的发展,AP患者多器官衰竭病死率逐步降低,而AP患者易位感染病死率仍居高不下[2-3]。肠道菌群是肠道内微生物总称,是肠道生物屏障的重要组成部分,在免疫成熟、肠道屏障等方面有重要作用[4]。动物研究显示,肠道菌群结构、多样性与重症AP之间存在密切联系,且可提示AP炎症反应强度[5]。本研究通过观察AP患者肠道菌群变化情况,分析肠道菌群变化与AP易位感染的关系,旨在指导未来评估AP患者易位感染风险与早期干预。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取商丘市中心医院2018年7月至2020年2月收治的182例AP患者,男92例,女90例,年龄26～54(40.31±5.33)岁,体重指数(body mass index,BMI)17.2～24.9(21.25±1.96)kg·m-2。病因:胆源性81例,脂源性35例,酒精性56例,其他10例。本研究经医院医学伦理委员会批准,患者及家属均知情且签署同意书。

1.2 入选标准

(1)纳入标准:①符合《急性胰腺炎诊治指南(2014版)》[6]中AP诊断标准;②经实验室检查提示血清淀粉酶水平≥正常上限3倍;③发病至入院时间≤1周。(2)排除标准:①合并心、肝、肾等重要器官功能异常;②合并恶性肿瘤;③合并其他感染性疾病;④合并免疫系统疾病;⑤合并血液系统疾病;⑥入院前2周使用抗生素或益生菌。

1.3 方法

1.3.1AP易位感染评估及分组

于患者入院后参照相关标准[7]评估AP易位感染发生情况,AP患者伴有发热、腹痛等表现,胰周坏死组织或血液检查等提示细菌学培养阳性,且影像学检查提示胰周有气体或空泡。将符合上述标准AP患者纳为易位感染组,反之纳为无感染组。

1.3.2肠道菌群检查

于患者入院后收集200 mg粪便标本置于无菌管内,存储在-80 ℃环境下待检;将200 mg粪便标本转移至2 mL离心管(1号)中,于管内滴加1.6 mL Buffer ASL溶液,充分摇匀后,置于70～95 ℃热水中水浴5 min,以14 000 r·min-1转速离心2 min,吸取上层清液放置另一2 mL离心管(2号)内;于放置清液离心管内加入inhibit EX药片,震荡至溶解后放于室温下静置2 min,然后以14 000 r·min-1转速离心3 min,吸取上层清液转移至另一2 mL离心管(3号)中,并再次以14 000 r·min-1转速离心3 min;吸取15 μL proteaseK溶液置于1.5 mL离心管(4号)中,于离心管内滴加200 μL上一步2 mL离心管内清液,再滴加200 μL Buffer ASL溶液,充分摇匀后震荡1 min;将4号离心管于95 ℃热水中水浴10 min后,滴加200 μL无水乙醇,并震荡摇匀;将4号离心管内溶液转移至离心管管柱内,以14 000 r·min-1转速离心1 min,然后再将离心管柱内溶液转移至另一2 mL离心管(5号)中,滴加500 μL Buffer AW1溶液,以14 000 r·min-1转速离心1 min,再将离心管柱置于2 mL离心管(6号)内;于6号离心管内滴加500 μL Buffer AW2溶液,以14 000 r·min-1转速离心1 min,再将离心管柱置于1.5 mL离心管中(7号)内,于离心管内滴加200 μL Buffer AE溶液,于室温下静置1 min,以14 000 r·min-1转速离心1 min,得到粪便DNA,置于-80 ℃环境下储存、待检;对肠道菌群进行荧光定量分析,细菌数量按照聚合酶链反应定量结果取对数后,以log10N/g粪便(湿重)表示,主要分析细菌为肠杆菌、肠球菌、双歧杆菌等;定量PCR反应条件、引物均参照文献[8]。

1.3.3一般资料调查

设计一般资料调查问卷,记录患者基本信息,包括性别、年龄、BMI、病因、实验室指标[血清D-乳酸水平(取患者清晨空腹肘部静脉血5 mL,以4 000 r·min-1转速离心10 min,以分光光度法检测血清D-乳酸水平)]等。

1.3.4统计学方法

2 结果

2.1 AP易位感染发生情况

182例AP患者41例发生易位感染,发生率为22.53%。

2.2 易位感染与未感染患者相关资料比较

两组性别、年龄、BMI、病因比较差异无统计学意义(P>0.05);易位感染组血清D-乳酸水平、肠杆菌、肠球菌数量均高于无感染组,双歧杆菌数量低于无感染组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 易位感染与未感染患者相关资料比较

2.3 肠道菌群对AP易位感染影响的多因素模型回归分析

将AP患者易位感染发生情况作为因变量(发生=1,未发生=0),将D-乳酸水平、肠杆菌、肠球菌、双歧杆菌作为协变量,建立logistic多因素回归模型,结果显示,D-乳酸水平过表达、肠杆菌过表达、肠球菌过表达、双歧杆菌低表达是AP患者易位感染发生的影响因素(P<0.05)。见表2。

表2 肠道菌群对AP易位感染影响的多因素模型回归分析

2.4 肠道菌群变化情况预测AP易位感染风险价值

将AP患者易位感染发生情况作为状态变量(发生=1,未发生=0),将肠道菌群(肠杆菌、肠球菌、双歧杆菌)作为检验变量,绘制ROC曲线,结果显示,肠杆菌、肠球菌、双歧杆菌均有较高的预测价值。见表3。

表3 肠道菌群变化情况预测AP易位感染发生风险价值分析

3 讨论

有研究显示,肠道细菌易位是导致AP患者并发感染的首要原因,会造成胰腺反复感染、坏死,且可能会增加脓毒血症发生风险,加重AP严重程度[9]。因此,早期明确易位感染风险,对早期预防易位感染发生、降低预后风险意义重大。

2014年,陈渝萍等[10]研究显示,重症AP患者血清D-乳酸水平高于轻症组、对照组,且轻症组D-乳酸水平高于对照组,提示D-乳酸水平可反映AP病情严重程度,指导临床干预。有研究显示,肠道屏障受损可能与肠道细菌失衡存在密切联系,且肠道屏障功能减弱会增加肠道细菌易位感染风险[11]。D-乳酸过表达是AP患者易位感染发生的影响因素。证实上述研究猜测。但血清D-乳酸检测结果易受其他因素影响,结果稳定性不佳,具体应用价值还需临床进一步证实。

肠道微生物群属于机体复杂群落,其不仅可促进肠道结构正常发育,还对维持肠道免疫成熟、免疫平衡等均具有重要作用[12]。健康人肠道菌群较固定,致病菌、益生菌处于平衡状态,共同维持正常肠道功能,但当某一菌群比例失衡,可能会影响肠道免疫及屏障功能[13]。肠杆菌、肠球菌是肠道内常见致病菌,其中肠杆菌属于细菌的一科,包括无芽孢、周身无鞭毛的革兰阴性直杆菌等,肠球菌属于革兰阳性球菌,正常情况下,粪便中肠球菌与肠杆菌比例为1∶10,但两者比例增高可能会导致肠道菌群失衡,削弱肠道黏膜屏障[14]。有研究显示,双歧杆菌水平可反映肠道微生态情况,若水平降低,多提示肠道微生物失衡,且可能会增加致病菌繁殖风险[15]。本研究结果显示,易位感染组肠杆菌、肠球菌数量均高于无感染组,双歧杆菌数量低于无感染组,提示AP易位感染患者伴有肠道菌群失衡状况;经多因素回归模型分析结果显示,肠杆菌过表达、肠球菌过表达、双歧杆菌低表达是AP患者易位感染发生的影响因素;进一步绘制ROC曲线发现,肠杆菌、肠球菌、双歧杆菌预测AP患者易位感染发生风险的AUC分别为0.895、0.933、0.879,均有一定预测价值,证实上述猜测。

4 结论

AP患者易位感染发生风险高,可能与患者肠道菌群失衡有关,未来可考虑检测肠道菌群变化,以评估AP患者易位感染发生风险,或可成为未来早期预防易位感染的新方向。