超高效液相色谱-串联质谱法测定动物源食品中16 种喹诺酮类药物的残留

林 欢，傅雅丽，孙仲葆

（黄石市食品药品检验检测中心，湖北黄石 435000）

喹诺酮类药物是一类人工合成的含有4-喹诺酮基本结构的广谱类抗生素，能有效控制革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌及其他细菌感染，因其具有抗菌谱广、抗菌力强、价格便宜，与其他抗菌药类物质不易产生耐药性和毒副作用小等优点，被广泛应用于畜牧、水产养殖中动物疾病的预防[1]。长期使用此类抗生素会造成动物源性食品中残留喹诺酮类药物，若长期食用这种喹诺酮类药物残留量过高的食物，会对人体健康产生危害[2]。随着动物养殖业发展集约化，养殖病害日益严重，各种细菌性和真菌性疾病频发，导致人们过量、违规、滥用喹诺酮类药物，继而引发细菌耐药性不断增强的问题，不仅污染环境，还会损害人体健康[3]。我国农业部公告第193 号、农业部公告第235 号、农业部公告第2292 号等文件中对部分喹诺酮药物进行了规定，不少药物已被我国和其他国家归为兽药禁药，所以建立动物源性食品中喹诺酮类药物的检测分析方法对保证食品安全至关重要。目前，此类抗生素的检测方法有很多，如微生物法[4]、液相色谱法、高效液相色谱法、酶联免疫法、毛细管电泳法以及电化学法等，但灵敏度不高。超高效液相色谱-串联质谱法（Ultra-High Performance Liquid Chromatography tandem Mass Spectrometry，UPLC-MS/MS）具有灵敏度高、专属性强等特点，因此本文使用该方法对动物源食品中16 种喹诺酮类药物残留进行检测。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Waters Xevo TQD 超高效液相色谱串联质谱联用仪，美国Waters 公司；pH 计，梅特勒公司；离心机，美国贝克曼公司；涡旋混合器，德国艾卡；超声波振荡仪，昆山市超声仪器有限公司；全自动平行浓缩氮吹仪，睿科集团（厦门）股份有限公司；Milli-Q超纯水仪；ME204E/JY20002 天子天平。

甲醇，色谱纯，默克公司；乙腈，质谱纯，默克公司；甲醇/二甲基亚砜中16 种喹诺酮混标溶液，100 μg·mL-1，上海安谱实验科技股份有限公司；柠檬酸、磷酸氢二钠、氢氧化钠、乙二胺四乙酸二钠，分析纯，国药集团；甲酸，色谱纯，安谱科技；超纯水（电阻率为18.3 MΩ·cm-1，由Milli-Q 超纯水系统制取）；PEP 固相萃取柱（200 mg/6 mL，Agela）。

1.2 实验方法

1.2.1 溶液的配制

（1）系列标准溶液的配制。精密吸取1.00 mL 混合标准溶液，用1‰的乙酸乙腈溶液溶解并定容至100 mL 容量瓶中，得到混合标准储备液（16 种化合物的质量浓度均为1 000 ng·mL-1）。将质量浓度为1 000 ng·mL-1的标准储备溶液用初始流动相逐级稀释为2 ～100 ng·mL-1的系列标准工作溶液，临用现配。

（2）EDTA-Mcllvaine 缓冲溶液的配制。称取42.02 g 柠檬酸试剂，用纯化水溶解并定容至2 000 mL，得到浓度为0.1 mol·L-1的柠檬酸溶液，然后称取143.26 g 磷酸氢二钠试剂，用纯化水溶解并定容至2 000 mL，得到浓度为0.2 mol·L-1的磷酸氢二钠溶液。将2 000 mL 0.1 mol·L-1的柠檬酸溶液与1 250 mL 0.2 mol·L-1的磷酸氢二钠溶液充分混合均匀，调节pH 值至4.0，得到Mcllvaine 缓冲溶液。再称取121 g 乙二胺四乙酸二钠试剂置于Mcllvaine 缓冲溶液中，充分振摇使其溶解。

1.2.2 样品前处理

称取新鲜猪肉样品5 g（精确至0.01 g）于50 mL离心管中，加入EDTA-Mcllvaine 缓冲溶液20 mL，用涡旋混合器混合约2 min，超声波振荡提取10 min，放入离心机中离心10 min（3 ℃、10 000 r·min-1），提取3 次，合并3 次提取的上清液，待净化。

使用时先活化HLB 固相萃取柱，用6 mL 甲醇洗涤，再用6 mL 水活化，待柱体水分抽干，将提取液过柱，弃去滤液，用2 mL 5%甲醇水溶液淋洗柱子，弃去淋洗液，待小柱抽干后，用6 mL 色谱纯甲醇洗脱固相萃取柱，收集全部洗脱液。将洗脱液置于全自动平行浓缩氮吹仪上（40 ℃）吹干，用1 mL 初始流动相（1‰甲酸乙腈溶液-1‰甲酸水溶液，95 ∶5）溶解定容，涡旋混合1 min，用孔径为0.22 μm 有机系微孔滤膜过滤，作为供试品溶液，于UPLC-MS/MS测定。

1.2.3 仪器条件

（1）色谱条件。Waters Acquity UPLC BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱温：40 ℃；样品室温度：15 ℃；流动相A 为0.1%甲酸水溶液，流动相B 为0.1%甲酸乙腈溶液；梯度洗脱：0 ～0.2 min，95%A；0.2 ～2.5 min，95%A→50%A；2.5 ～3.5 min，50%A→5%A；3.5 ～4.5 min，5%A；4.5 ～4.6 min，5%A→95%A；4.6 ～7.0 min，95%A；流速：0.4 mL·min-1；进样量：5 μL。

（2）质谱条件。电喷雾电离源；电离模式为ESI+；扫描模式为多反应监测模式（MRM）；毛细管电压为3.00 kV；离子源温度为150 ℃；脱溶剂气的温度为550 ℃；锥孔气体的流量为50 L·Hr-1；脱溶剂气体的流量为1 000 L·Hr-1，碰撞气为氩气。16 种喹诺酮类化合物MRM 模式质谱优化参数见表1。

表1 16 种喹诺酮类化合物MRM 模式质谱优化参数及保留时间

2 结果与分析

2.1 提取及净化方法的选择

目前，国标中检测动物源食品中喹诺酮类药物残留的提取净化方法有经酸化的乙腈提取后用正己烷净化、甲酸-乙腈提取后于分液漏斗中用饱和乙腈正己烷净化、磷酸盐缓冲液提取后用Varian BondElut C18柱（100 mg·mL-1）净化[5]和QuEChERS 法[6]等，但操作步骤复杂繁多，回收率不高。为了减少基质干扰，需要对提取液中残留的蛋白质及脂肪进行二次净化，以确保目标化合物定量的准确性。HLB 固相萃取柱常用来进行脂质和蛋白质等基质组分的净化，所以本文采用Cleanert PEP-2 200 mg/6 mL 固相萃取小柱，能清除样品中90%的磷脂和脂肪，处理过程简单、方便、快速。

2.2 线性关系、检出限和定量限

配制各目标化合物浓度为2 ng·mL-1、5 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、50 ng·mL-1、80 ng·mL-1和100 ng·mL-1的标准溶液，通过仪器检测后，以待测物质的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。结果显示，各目标化合物在2 ～100 ng·mL-1的浓度内线性相关良好，相关系数均大于0.991，满足日常检测需求。基于标准曲线中的最低响应，以3 倍信噪比和10 倍信噪比确定检出限和定量限，结果见表2。

表2 16 种喹诺酮类化合物的线性方程、相关系数、检出限及定量限

2.3 方法回收率及精密度

准确称取5 g 不含喹诺酮类药物的阴性样品（猪肉）于50 mL 离心管中，设定3 个添加水平，即5.0μg·kg-1（添 加1）、20.0 μg·kg-1（添 加2）、50.0 μg·kg-1（添加3），准确吸取1 000 ng·mL-1的喹诺酮混合标准储备溶液25 μL、100 μL、250 μL分别加入样品管中（加标量分别为25 ng、100 ng、250 ng），按1.2.2 同法进行前处理，进行添加回收率测定，每个添加水平进行6 次平行实验。由表3 可知，16 种喹诺酮类化合物的回收率在81.9%～106.8%，RSD 为1.3%～12.8%。

表3 阴性样品中16 种喹诺酮类化合物的加标回收率和相对标准偏差（n=6）

3 结论

本文在建立同时检测动物源食品中16 种喹诺酮类化合物残留量的超高效液相色谱-串联质谱法的基础上，对动物源食品中的目标化合物的提取和净化方法进行了优化，最终选择EDTA-Mcllvaine 缓冲溶液作为提取液对样品进行提取，HLB 固相萃取柱净化富集。方法学验证结果表明该方法准确、可靠，检出限和检测范围均满足《食品安全国家标准 食品中兽药最大残留限量》（GB 31650—2019）对16 种喹诺酮类化合物的要求，可满足常规实验室日常检测需求，对准确监测动物源食品喹诺酮类药物残留风险具有重要意义。