青花椒提取物对金黄色葡萄球菌抑制作用研究

张文艳，李茂东，黄 堃，赵仲霞，阮苏梦，师 睿*

（1.昭通学院 化学化工学院，云南昭通 657000；2.云南三鑫职业技术学院 医药健康学院，云南文山 663000）

花椒是药食两用的植物性原料，研究花椒的抑菌活性意义重大[1]。本研究从天然抑菌产物角度出发，研究青花椒提取物对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的抑制作用，深化昭通农副产品的精深加工[2]。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

青花椒，昭通市永善县；营养肉汤培养基、营养琼脂，广东环凯微生物科技有限公司；钾离子检测试剂盒，南京建成生物工程研究所；96 孔板，NEST；移液枪，大龙兴创实验仪器（北京）有限公司；PT-3502 C 全波长酶标分析，北京普天新桥技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 青花椒提取物的制备

粉碎后过60 目筛的青花椒与75%酒精按照料液比1 ∶15（m∶v）混合，浸泡过夜，50 ℃超声提取50 min，滤液浓缩至浸膏，配制成母液，过滤除菌，-80 ℃保存备用。

1.2.2 滤纸片的准备

用6 mm 打孔器对滤纸打孔，121 ℃灭菌15 min，烘干备用，灭菌后的滤纸不能久放，否则会影响实验结果的可靠性[3]。

1.2.3 菌悬液的制备与测定

菌悬液浓度为107CFU·mL-1，避光培养温度为37 ℃，于600 nm 处测定吸光值。

1.2.4 青花椒提取物对金黄色葡萄球菌抑制作用研究

（1）抑菌圈的测定。在培养基凝固后，每皿加入1 mL 菌悬液进行平板涂布，而后沿同一方向等距离贴上滤纸片，滤纸片所加青花椒提取物为10 μL，无菌水为对照组，设置4 个实验组，将青花椒提取物稀释成30 mg·mL-1、60 mg·mL-1、120 mg·mL-1和240 mg·mL-1，培养24 h 后十字交叉法测量抑菌圈大小，每组3 个平行。

（2）青花椒提取物最小抑菌浓度的测定。最小抑 菌 浓 度（Minimal Inhibitory Concentration，MIC）测 定 方 法 参 考ABREU 等[4]和BEEVI 等[5]的 方法，以空白培养基为对照组，设置4 个实验组，以107CFU·mL-1菌液作为稀释液，将青花椒提取物配制成40 mg·mL-1、50 mg·mL-1、60 mg·mL-1和70 mg·mL-1，每组3 个平行。分别取稀释后不同浓度的青花椒提取物，以每 孔200 μL 加入96 孔板，培养24 h 后600 nm 处测定吸光值[6]。MIC 计算公式为

（3）青花椒提取物最小杀菌浓度的测定。最小杀菌 浓 度（Minimum Bactericidal Concentration，MBC）测定方法参考李静慧[7]和郭雪梅[8]的方法，即青花椒提取物抑制99.9%的金黄色葡萄球菌生长所需的浓度[9]。以空白培养基为对照组，设置4 个实验组，以107CFU·mL-1菌液作为稀释液，将青花椒提取 物 配 制 成60 mg·mL-1、70 mg·mL-1、80 mg·mL-1和90 mg·mL-1，每组3 个平行。分别取稀释后不同浓度的青花椒提取物，以每孔200 μL 加入96 孔板，培养24 h 后检测600 nm 处的吸光值。同时每孔取50 μL 培养液加入营养肉汤琼脂培养基进行平板涂布，37 ℃避光培养24 h，计数菌落，最终选择抑菌率≥99.9%，且平板涂布培养后菌落数≤5 CFU 所对应的青花椒提取物浓度为该供试菌的MBC 值[10]。MBC 计算公式为

（4）生长抑制曲线的测定。参考陈屹[11]、张雅静[12]和李冬冬[13]的方法，以菌悬液为对照组，设置3 个实验组，以107CFU·mL-1菌液作为稀释液，将青花椒提取物配制成50 mg·mL-1、70 mg·mL-1、80 mg·mL-1，每组3 个平行。分别取稀释后不同浓度的青花椒提取物，以每孔200 μL 加入96 孔板，每2 h 检测一次600 nm 处的吸光值，测定金黄色葡萄球菌的生长情况[14]。

（5）青花椒提取物对金黄色葡萄球菌膜通透性的影响。以菌悬液为对照组，设置4 个实验组，以107CFU·mL-1菌液作为稀释液，将青花椒提取物配制成50 mg·mL-1、60 mg·mL-1、70 mg·mL-1和80 mg·mL-1，于80 r·min-1避光培养6 h，5 000 r·min-1离心5 min，收集细胞上清液，按照钾离子检测盒说明书测定金黄色葡萄球菌细胞上清液中钾离子的含量。

（6）青花椒提取物对金黄色葡萄球菌内容物的影响。菌悬液为对照组，设置2 个实验组，以107CFU·mL-1菌液作为稀释液，将青花椒提取物配制成50 mg·mL-1、70 mg·mL-1，于100 r·min-1避光培养，每2 h 取 一 次 样，培 养 结 束 后5 000 r·min-1离 心5 min，收集上清，260 nm 处检测吸光值。

2 结果与分析

2.1 抑菌圈的测定结果

由表1 可知，青花椒提取物作用于金黄色葡萄球菌后，均能产生一定大小的抑菌圈。

表1 青花椒提取物对金黄色葡萄球菌抑菌效果的测定

2.2 青花椒提取物对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度

由图1 可知，当青花椒提取物浓度为60 mg·mL-1时，抑菌率为79.45%；当青花椒提取物浓度为70 mg·mL-1时，抑菌率为97.59%，大于90%。因此，青花椒提取物作用于金黄色葡萄球菌后MIC 值为70 mg·mL-1。

图1 不同浓度青花椒提取物作用于金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度

2.3 青花椒提取物对金黄色葡萄球菌的最小杀菌浓度

由图2、表2 可知，当青花椒提取物浓度为80 mg·mL-1时，抑菌率≥99.9%，且平板涂布培养后菌落数≤5 CFU。因此，青花椒提取物作用于金黄色葡萄球菌后MBC 值为80 mg·mL-1。

图2 不同浓度青花椒提取物作用于金黄色葡萄球菌的最小杀菌浓度

表2 不同浓度青花椒提取物作用于金黄色葡萄球菌的菌落计数

2.4 青花椒提取物对金黄色葡萄球菌的生长抑制曲线

由图3 可知，青花椒提取物作用于金黄色葡萄球菌后对其生长均有抑制作用。

图3 青花椒提取物对金黄色葡萄球菌的生长抑制曲线

2.5 青花椒提取物对金黄色葡萄球菌细胞膜通透性的影响情况

青花椒提取物作用于金黄色葡萄球菌后，检测细胞上清液中钾离子含量，以此反映青花椒提取物作用下金黄色葡萄球菌细胞膜的通透性。根据试剂盒说明书，绘制钾离子标准曲线，y=1.483 8x-0.023 7，R2=0.998 9，如图4 所示。由图5 可知，青花椒提取物作用于金黄色葡萄球菌后，80 mg·mL-1对金黄色葡萄球菌膜的通透性影响最大，表明K+泄漏到胞外培养液中，青花椒提取物作用于金黄色葡萄球菌后，增加了细胞膜的通透性。

图4 钾离子标准曲线

图5 金黄色葡萄球菌膜通透性情况

2.6 青花椒提取物对金黄色葡萄球菌内容物泄露量的影响

检测260 nm 处的吸光值，判断青花椒提取物作用于金黄色葡萄球菌后内容物的泄露量。由图6 可知，青花椒提取物作用于金黄色葡萄球菌后，70 mg·mL-1时内容物泄露最多，其次是50 mg·mL-1，表明青花椒提取物作用于金黄色葡萄球菌后破坏了细胞膜的完整性，导致胞内物质发生泄露。

图6 青花椒提取物对金黄色葡萄球菌内容物泄露量的影响

3 结论

本研究将青花椒提取物作用于金黄色葡萄球菌，探究青花椒提取物的抑菌活性，结果显示，菌体缓慢生长，MIC 为70 mg·mL-1，MBC 为80 mg·mL-1，钾离子、内容物发生不同程度的泄露，表明青花椒提取物对金黄色葡萄球菌具有抑制作用。