解毒消癥饮调控β-catenin转位抑制人Huh7和PLC/PRF/5细胞株侧群细胞增殖的机制

杨瑞明 薛易 江芷珊 曹治云 陈旭征

1福建中医药大学中西医结合研究院，福州 350122；2福建省中西医结合老年性疾病重点实验室，福州 350122；3福建中医药大学药学院，福州 350122

中药复方解毒消癥饮（Jiedu Xiaozheng Yin，JXY）是全国名中医杜建教授的自拟经验方，成分包括白花蛇舌草、夏枯草、山慈菇和苦参，临床上主要用于热毒炽盛证型的消化道肿瘤患者，具有清热解毒、消肿散结等功效。研究发现，JXY乙酸乙酯提取物（ethyl acetate extract from JXY，EE-JXY）可以通过Wnt/β-Catenin通路抑制肝癌细胞的增殖［1］。EE-JXY还被发现可以降低肝癌侧群（side population，SP）细胞在肝癌细胞中的比例，并抑制肝癌细胞中具有干性特征的相关因子CD133、c-kit、Oct4、Nanog、Sox2等的表达［2-3］，可能具有抑制肝癌干细胞生长的作用。但是，EE-JXY抑制肝癌干细胞生长的作用是否也与Wnt/β-Catenin通路相关尚未可知。2023年1月至5月，本研究通过体外培养Huh7和PLC/PRF/5人肝癌细胞株，观察EE-JXY对肝癌细胞中SP细胞比例的影响，并对分选出的SP细胞进行平板克隆实验和克隆球形成实验，从Wnt/β-Catenin通路进一步阐明EE-JXY抑制肝癌干细胞生长的作用机制，为EE-JXY在临床肝癌防治中的应用提供实验依据。

材料与方法

1.试剂和仪器

胎牛血清、DMEM/F12培养基购自美国Gibco公司；高糖DMEM培养基、胰蛋白酶购自美国Hyclone公司；维拉帕米（Verapamil）、Hoechst33342染料购自美国Sigma公司；青霉素-链霉素混合溶液（100×双抗）、重组人碱性成纤维生长因子（bFGF）、重组人表皮生长因子（EGF）购自美国PeproTech公司；B27购自美国Invitrogen公司；β-catenin抗体购自英国Abcam公司；4'，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）、Alexa Fluor 555标记的驴抗兔二抗、结晶紫染料购自碧云天生物公司。

倒置显微镜系统（德国Leica公司）；二氧化碳培养箱、超净工作台（苏州净化设备有限公司）；低速离心机（美国Thermo Fisher Scientific公司）；MOFLO XDP分选型流式细胞仪（美国Beckman coulter公司）；细胞计数仪（美国CountStar公司）；高内涵细胞分析系统Pathway 855（美国BD Biosciences公司）。

2.细胞培养

人肝癌细胞株Huh7和PLC/PRF/5细胞购买于中国上海中科院细胞库，细胞培养于含有10%胎牛血清的高糖DMEM培养基中（含1×105U/L的青链霉素），放在条件为37 ℃、5% CO2饱和湿度的培养箱中培养及传代。

3.EE-JXY的制备

白花蛇舌草、山慈菇、夏枯草、苦参从香港培力药业有限公司购买，按照2∶1∶1∶1的比例混合并粉碎均匀，10倍体积的75%乙醇浸泡30 min，回流提取2遍，每遍1 h，随即混合提取液，过滤后采用旋转蒸发仪减压浓缩。浓缩液经石油醚萃取3次，乙酸乙酯萃取3次，归并乙酸乙酯萃取液，再次采用旋转蒸发仪进行减压浓缩，真空干燥后获得粉末，即EE-JXY。

4.流式细胞仪检测SP细胞比例并分选

将人肝癌细胞Huh7和PLC/PRF/5接种在6孔板中，0.25 g/L的EE-JXY分别干预24 h，消化细胞，制备成浓度为1×109个/L的单细胞悬液，再加入Hoechst33342染料，使染料的终浓度为5 mg/L，将水浴锅升温至37 ℃，将制备好的细胞悬液避光振荡90 min，于4 ℃离心，在预冷的含2%胎牛血清的高糖DMEM培养基中重悬细胞，加入终浓度为2 mg/L的PI染液用以排除死亡细胞，上流式细胞仪检测SP细胞的比例并分选。实验同时设置Verapamil组，即在加入Hoechst33342染料的同时加入终浓度为50 μmol/L的Verapamil，其余步骤与其他各组相同。

5.平板克隆实验

将上述实验分选到的Huh7和PLC/PRF/5肝癌SP细胞悬液以200个/孔的细胞数接种在6孔板中，并缓慢晃动，使细胞均匀分布，培养2～3周。当观察到6孔板中出现明显的克隆时停止培养，弃去上清，用PBS洗涤1次，4%多聚甲醛固定细胞，并用结晶紫染色15 min，PBS洗涤后拍照。

6.克隆球形成实验

将Huh7和PLC/PRF/5肝癌SP细胞接种在超低黏附6孔板中，按3×108个/L的密度接种培养过夜，用EE-JXY干预24 h，然后消化离心，并按500个/孔的密度把收集的细胞再次分别接种于超低黏附6孔板，在干细胞培养液中继续培养10 d。期间，每隔3 d添加1 ml干细胞培养基［含有B-27（1∶50）、bFGF（20 μg/L）、EGF（20 μg/L）的DMEM/F12培养液］，倒置显微镜下观察克隆球的形态和数量，并拍照。

7.免疫细胞荧光染色

将分选后的Huh7肝癌SP细胞接种在96孔板中24 h，0.25 g/L EE-JXY处理后，用4%多聚甲醛固定细胞10 min，在含有Triton X-100的阻断缓冲液中孵育20 min。兔抗β-catenin抗体（1∶250），在4 °C下孵育过夜。PBS冲洗3次，每次10 min，细胞在Alexa Fluor 555标记的驴抗兔二抗（1∶1 000）避光孵育2 h，再冲洗3次后，孔中加入300 μg/L的DAPI染色5 min后，使用高内涵细胞分析系统检测荧光表达的位置。

结果

1.EE-JXY降低Huh7和PLC/PRF/5细胞中SP细胞的比例

利用SP细胞具有将Hoechst33342染料泵出细胞外的特性，笔者通过流式细胞术检测了肝癌细胞中SP细胞的比例。结果如图1所示，Hoechst33342染料在紫外激发光的作用下，可发射450 nm（FL6）的蓝光和675 nm（FL7）的红光。但是，由于SP细胞对Hoechst33342染料拒染，在流式细胞图上显示为左下方有一群Hoechst33342荧光低表达的细胞群。当肝癌细胞未受到干预的时候，SP细胞含量在PLC/PRF/5中约占9.92%（图1a），在Huh7中约占1.10%（图1d）；当加入Verapamil后，这群细胞数量有所减少或完全消失（图1b和1e）。当EE-JXY干预Huh7和PLC/PRF/5细胞24h后，PLC/PRF/5细胞中SP细胞含量从9.92%下降至0.59%，Huh7细胞中SP细胞含量从1.10%下降至0.58%，都有很明显的下降趋势（图1c、图1f），可见EE-JXY可以显著降低SP细胞在肝癌细胞中的占比。

图1 EE-JXY对Huh7和PLC/PRF/5细胞中SP细胞含量的影响

2.EE-JXY抑制分选后的Huh7和PLC/PRF/5肝癌SP细胞的克隆形成

如图2所示，将上述流式细胞术分选出的Huh7和PLC/PRF/5肝癌SP细胞接种在6孔板中进行平板克隆实验，结果发现，未受干预的SP细胞正常培养2～3周后均出现散在的克隆，大小不一，而经0.25 g/L的EE-JXY干预后分选出的SP细胞形成克隆的数量明显减少，说明给药后SP细胞的增殖能力明显下降，难以形成克隆。

图2 EE-JXY抑制肝癌SP细胞的克隆形成

3.EE-JXY对分选后肝癌SP细胞体外成球能力的影响

如图3所示，在倒置显微镜下观察克隆球数目，可见分选后的未受干预的Huh7和PLC/PRF/5肝癌SP细胞生长旺盛，成球状况良好，而EE-JXY干预后克隆球数目较空白组明显减少，说明EE-JXY减弱了肝癌SP细胞体外成球的能力，抑制了肝癌SP细胞的增殖。

图3 EE-JXY抑制肝癌SP细胞克隆球的形成（200×）

4.EE-JXY对肝癌SP细胞Wnt/β-catenin通路中β-catenin蛋白转位的影响

如图4所示，在未处理的SP细胞中，β-catenin主要聚集在细胞质或细胞核中。经EE-JXY处理后，β-catenin出现在部分细胞的细胞膜中。显然，EE-JXY可以促进β-catenin从细胞浆向细胞膜的转位，这说明EE-JXY可以抑制β-catenin的活性。

图4 EE-JXY对肝癌SP细胞β-catenin蛋白转位的影响（400×）

讨论

肝细胞性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球常见的恶性肿瘤。目前，其治疗方法主要有手术切除、放化疗、靶向药物治疗等，但是由于肝癌细胞易转移、对放化疗和靶向药物不敏感，以及这些药物严重的不良反应等特点导致患者生存率没有显著提高。许多中药复方在辅助肿瘤治疗中发挥着良好的增效减毒作用，如在抑制肝癌细胞增殖、抑制肝癌细胞侵袭、诱导肝癌细胞凋亡等方面均被发现有很好的功效［4］。有关中药复方抑制肝癌生长的作用机制，目前大多数研究以肝癌细胞为主要研究对象，较少关注肝癌组织中的癌干细胞（cancer stem cells，CSCs），而CSCs正是癌症转移的关键［5-6］。这群细胞因具有不断自我更新、无限增殖等干细胞样特性，具有一定的化疗抵抗能力，导致肝癌易复发转移［7］。目前，人们在研究肝癌CSCs的过程中还没有发现一种灵敏度和特异度均较高的标志物。因此，对于了解肝癌CSCs有哪些特点、抗癌靶点的筛选以及肝癌CSCs的功能进行研究成了疑难问题［8］。近年来，学者们研究癌症时发现一些细胞群可以将Hoechst33342荧光染料从细胞核排出细胞外，流式细胞术和荧光显微镜检测均未观察到染色或弱染色，学者称其为SP细胞。SP细胞具有自我更新、多向分化、耐药性及高致瘤性，这些特征与CSCs特征非常相似，SP细胞逐渐成为CSCs研究的切入点［9-10］。

CSCs发挥其干细胞样特性与几条信号通路如Wnt/β-catenin、Hippo-YAP/TAZ、JAK/STAT、Notch等关系密切，其中Wnt/β-catenin信号通路是研究最为明确的一条［11-13］。当该通路没有被Wnt配体激活时，β-catenin汇聚在细胞质内，不能向核内易位，β-catenin会被糖原合成酶激酶3β（GSK3β）、酪蛋白激酶1（CK1）磷酸化，从而引起有关的蛋白酶体降解；当Wnt配体存在时，与细胞膜上的卷曲同源物和肺耐药蛋白5/6（LRP5/6）结合并且受体共表达，激活该通路，细胞质内的β-catenin不会被GSK3β磷酸化，β-catenin转移到细胞核内，调节Wnt信号通路下游的相关靶基因，然后发挥一系列的作用［14-15］。Wnt/β-catenin信号通路在CSCs中发挥着重要功能，促进CSCs耐药和转移，维持CSCs的增殖生长、自我更新和干细胞表型［16-18］。研究发现，EE-JXY可以明显改善Huh7细胞对小剂量化疗药的抵抗，也可以抑制Hep3B细胞的干细胞样特性，EE-JXY通过wnt/β-catenin通路抑制肝癌细胞增殖［2］。本研究首先对分选出来的Huh7和PLC/PRF/5细胞的SP细胞的百分含量进行测定，可以看出，在正常的Huh7和PLC/PRF/5细胞中SP细胞是有一定存在比例的，加入Verapamil后PLC/PRF/5和Huh7细胞中SP细胞的比例下降，这是因为SP细胞高表达ATP结合蛋白G2（ABCG2），这种蛋白可以将有毒的药物排出细胞外，逃避化疗药物的损害，而Verapamil会特异性阻断ABCG2，使其不能发挥功能，干细胞就会被杀伤，SP细胞含量显著降低。本研究发现，EE-JXY能显著降低肝细胞株中SP细胞的比例，与Verapamil有相同的作用，这说明EE-JXY对肝癌CSCs的抑制能力比对肝癌细胞更加敏感。紧接着本研究分选出这两种细胞的SP细胞进行平板克隆实验和克隆球实验，发现EE-JXY组SP细胞平板克隆能力和克隆成球能力均明显下降，进一步说明JXY可以抑制SP细胞的生长和增殖。鉴于前期发现EE-JXY可以通过Wnt/β-catenin信号通路抑制肝癌细胞的生长，本研究还考察了EE-JXY对肝癌SP细胞β-catenin的表达是否有抑制作用［19-20］，结果发现，正常情况下β-catenin多表达在细胞浆和细胞核内，加了EE-JXY后部分细胞的β-catenin转位到了细胞膜上，说明EE-JXY抑制了β-catenin的活化。

综上所述，EE-JXY可能通过影响Wnt/β-catenin信号通路，抑制β-catenin的活化，进而影响SP细胞的增殖，这可能是EE-JXY抑制肝癌细胞生长的机制之一。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献声明杨瑞明、薛易、江芷珊：实施研究，采集数据，起草文章，统计分析；曹治云：酝酿和设计试验，对文章的知识性内容作批评性阅读，支持性贡献；陈旭征：酝酿和设计试验，对文章的知识性内容作批评性阅读，统计分析，获取研究经费，指导，支持性贡献