琼脂糖粉的质量对PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳的影响

兰柳波 张志珍 李彩虹 张海涛 林小聪 刘勇军 马卫列 丁航

摘 要：目的：研究琼脂糖粉的质量对聚合酶链式反应（PCR）产物琼脂糖凝胶电泳的影响。方法：PCR产物琼脂糖凝胶电泳中分别使用不同牌子的琼脂糖粉，同时跑胶图像。结果：质量差的琼脂糖粉电泳结果有明显弥散现象，而更换高质量的琼脂糖粉，未见弥散现象。结论：琼脂糖粉质量在分子生物学PCR产物琼脂糖凝胶电泳实验中扮演重要角色，使用高质量的琼脂糖粉对实验的成功至关重要。

关键词：琼脂糖粉；PCR；扩增产物；琼脂糖凝胶电泳

Effect of the Quality of Agarose Powder on

Agarose Gel Electrophoresis of PCR Products

Lan Liubo1，2 Zhang Zhizhen1，2 Li Caihong 1，2 Zhang Haitao1，2 Lin Xiaocong1，2

Liu Yongjun1，2 Ma Weilie1，2 Ding Hang1，2*

1.Department of Biochemistry and molecular biology，Guangdong Medical University GuangdongDongguan 523808；

2.Laboratory of Modern Biochemistry and Molecular Biology，Guangdong Key Laboratory of Higher Education

GuangdongZhanjiang 524023

Abstract：Objective To study the effect of the quality of agarose powder on agarose gel electrophoresis of polymerase chain reaction（PCR）products.Methods High quality agarose powder and low quality agarose powder were used in PCR product agarose gel electrophoresis.Results The agarose powder with poor quality showed obvious dispersion，while the agarose powder with high quality did not.Conclusion The quality of agarose powder plays an important role in the experiment of molecular biological PCR product agarose gel electrophoresis.The use of high quality agarose powder is very important for the success of the experiment.

Keywords：agarose powder；PCR；amplification products；agarose gel electrophoresis

生物化學与分子生物学是目前自然科学中进展最迅速、最具活力的前沿领域，是一门研究核酸等生物大分子的功能、形态结构特征及其重要性和规律性的科学，是人类从微观即分子的角度来研究生物世界的奥秘、阐明生命现象本质的基础学科［1］。生物化学与分子生物学作为连接基础医学和临床医学的桥梁，是每一名医药专业学生的必修课，主要为从分子水平解释疾病发生的作用机制，快速、精准地找到治疗靶点，为疾病诊断和治疗提供理论支撑［2］。而实验教学是生物化学与分子生物学课程的一个非常重要的组成部分，对提高课程教学效果起到最直接和重要的作用［24］，我们必须重视实验教学。为了提高生物化学与分子生物学教学质量，我们开设了两个综合性提高型实验项目：

（1）总RNA提取和反转录（RT）、PCR扩增；

（2）质粒DNA的转化、制备及DNA的限制性内切酶酶切分析，帮助学生更加直观地了解生物化学与分子生物这门微观的课程，掌握分子生物学研究技术和方法。

通过对科研思维和创新能力的培养，全方位提升学生分析问题和解决问题的能力，从而掌握生命科学研究的主要途径。

为了让学生在实验中得到更好的效果，我们通过研究琼脂糖粉的质量对PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳的影响，提示学生在做PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳应注意的相关事宜。

1 方法

1.1 样品的制备

所有样品是我们实验中所获得的PCR扩增产物。DNA模板：重组人蛋白激酶CK2β亚基cDNA重组质粒（pTCKB，3087bp）。PCR反应：引物（上海生工合成）：上游引物：5AATCTAGACATATGAGCAGCTCAGAGGAGGT3，下游引物：5AAGGATCCAAGCTTCAGCGAATCGTCTTGACTGG3。反应条件：94℃预变性5分钟，扩增25个循环（变性：94℃30s，退火：55℃30s，延伸：72℃30s），72℃再延伸5min，4℃保存。PCR反应体系如表1。

1.2 制胶

0.8%琼脂糖凝胶（含核酸染料）：取2个200mL锥形瓶，分别称取0.32g不同品牌琼脂糖凝胶粉末，倒入装有40mL1×TBE电泳缓冲液的锥形瓶，摇匀；置微波炉中加热至琼脂糖粉末完全溶解，液体清澈透明；待冷却到约50℃时分别加入2μL的SYBR Green I核酸荧光染料，摇匀后倾倒至胶模中，冷却［5］。

1.3 电泳、染色及拍照

用移液器分别取20μL染色后的PCR样品及15μL DNA Marker，垂直加入凝胶的加样孔里，恒压150V电泳30min，电泳完毕后分别在电泳槽中及凝胶成像系统中观察，拍照。

2 结果

2.1 品牌A琼脂糖粉

PCR扩增产物条带均有弥散现象，DNA Marker分不开，见图1、图2。

2.2 品牌B琼脂糖粉

PCR扩增产物条带亮度适中、无“拖尾”或弥散现象、条带单一，见图3、图4。

3 讨论

PCR技术是1985年，美国PE2cetus公司人类遗传研究室的Mullis等人发明的［6］。PCR是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点［7］。PCR技术无疑给分子生物学带来了革命，它使扩增和克隆基因成为常规操作程序，目前，在基因定点突变、c DNA文库构建、基因测序、基因克隆、载体构建以及人类基因组计划等领域PCR技术得到广泛应用并发挥着重要作用［8］，也为DNA指纹鉴定、亲子和亲缘关系的鉴定和那些遗传和病原菌引起的疾病的诊断成为可能［910］。在今天的“基因大战”中，新基因的发现与克隆已成为研究的热点［11］。而PCR的结果准确性如何？是否可靠？产物是否为特异性扩增？这些都必须通过琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳对其进行分析和鉴定，才可以有正确的结论。

琼脂糖凝胶电泳主要是采用琼脂糖作为支持介质的电泳方法，琼脂糖凝胶电泳技术的分析原理与其他支持物电泳的最主要的区别是它具有电荷效应和分子筛效应双重作用，但主要是分子筛效应［11］。DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，借助琼脂糖凝胶的分子筛作用，混悬于溶液中的样品电荷颗粒在电场影响下向着与自身相反电荷的电极移动，DNA片段因其分子量或者分子形状的不同，泳动速度有差异而达到分离效果［11］。琼脂糖凝胶电泳是DNA片段分离、检测最常用的技术之一［12］，也是高校生物化学与分子生物学实践教学的重要环节。核酸染料与琼脂糖凝胶中DNA片段结合后，从紫外分析仪下可观察染料发出的荧光，并根据Marker条带的分子量标准判断PCR产物的位置和大小。DNA琼脂糖凝胶电泳所需要的试剂包括琼脂糖粉、核酸染料、电泳缓冲液等，琼脂糖粉溶解的质量、电泳缓冲液的质量、电压的大小、PCR产物的质量、加样孔的大小以及上样过程等都可以影响DNA电泳条带的质量［5，13，14］。

本实验过程中发现，品牌A琼脂糖粉加热完全溶解后液体不够透明，含的杂质比品牌B的多，而品牌B琼脂糖粉溶解后液体透明清澈。结果也显示，用品牌A琼脂糖粉跑出的带有弥散、拖尾的现象，而用品牌B琼脂糖粉跑出的带无“拖尾”或弥散现象、条带单一。质量不好的琼脂糖粉杂质多，影响琼脂糖的分子筛效应，所以在核酸电泳时若出现DNA或RNA分子条带扭曲或出现“拖尾”后，在排除电压过高、电泳液离子强度不适中、PCR产物本身质量、核酸染料质量的前提下［5］，应该考虑到琼脂糖粉的质量问题，更换琼脂糖粉或可解决。

参考文献：

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基金项目：广东省本科高校教学质量与教学改革工程建设项目（粤教高函〔2021〕29号）；2022年度广东省教育科学规划课题（2022GXJK207）；2022年广东省研究生教育创新计划项目（2022SFKC061）；广东医科大学2022年度校级本科教学质量与教学改革工程项目（1JG22145）

作者简介：兰柳波（1975— ），男，漢族，广西柳州人，硕士，讲师，研究方向：中草药的生化药理学。

*通讯作者：丁航（1968— ），女，汉族，海南文昌人，本科，高级实验师，研究方向：天然药物活性分析。