甘草酸抑制肿瘤的网络药理和分子对接分析

郭伟强， 吴天惠， 陈子明， 张 杰， 张佳钰， 胡翠英， 秦粉菊

（苏州科技大学化学与生命科学学院，江苏 苏州 215009）

癌症是排位第二的死亡原因，严重危害人民群众的身心健康。 据统计，2022 年，美国新发肿瘤195 多万例，新增死亡病例接近61 万；而我国新增406.4 万例癌症患者，且我国恶性肿瘤发病率高于全球平均水平[1-2]。 目前，肿瘤治疗仍以手术、化疗、放疗及靶向治疗为主，但化疗和靶向治疗的耐药现象以及毒副作用等因素使得患者难以获得较为合适的治疗效果。 因此，探讨找寻更加有效且安全的治疗药物或方法极具临床意义和价值。

中草药是中华民族的传统瑰宝，其疗效在长期的实践中已得到确认，从中草药中寻找有活性的成分是药物开发及先导药物筛选的有效途径和捷径[3]。 甘草酸（Glycyrrhizic Acid，GA，如图1 所示），属五环三萜类化合物，是甘草中含量最高、生物活性较强的有效成分之一，具有抗炎、抗氧化和抗肿瘤等作用。 已有研究发现，GA 通过抑制SIRT3、ROS、AKT 等通路实现抑制肿瘤细胞增殖、诱导凋亡等作用[4-6]。 虽然GA 的抗肿瘤活性和作用机制研究取得一定的成果，但由于中药成分存在着多靶点、多作用通路现象，深入全面地分析其作用靶点和作用机制具有重要意义。

图1 甘草酸结构式

随着生物信息学、系统生物学、分子药理学等科学的飞速发展，建立在组学和多向药理学基础上的网络药理学备受关注。其已被广泛应用于天然产物的活性成分分析、作用靶蛋白找寻和药理机制诠释之中，极大地促进了药物发现和重定位[7]。 文中研究基于网络药理学方法，经反向对接预测、GO/KEGG 富集分析、蛋白-蛋白互作用分析、分子对接验证等，预测分析GA 抗肿瘤的作用机制和潜在作用靶蛋白，为以GA 为先导物的抗肿瘤药物开发提供参考和依据。

1 材料和方法

1.1 GA 的靶蛋白预测

利用Super-PRED 数据库中的Target Prediction 模块（https：//prediction.charite.de/subpages/target_prediction.php）导入GA 结构式，预测其潜在作用靶蛋白，随后将预测结果保存，以便后续分析。

1.2 相关疾病分析和抗肿瘤靶蛋白的筛选

将上述所预测的潜在靶蛋白输入CTD 数据库（ctdbase.org/about/），根据医学主题词的疾病分类，筛选获得癌症的相关条目，得到GA 相关的潜在抗肿瘤靶蛋白。

1.3 “GA-靶蛋白-肿瘤”网络构建

以GA、 潜在抗肿瘤靶蛋白和对应癌症类型等为节点， 在Excel 中建立彼此对应关系， 随后导入Cytoscape 软件中，利用Network Analyzer 插件构建“GA-靶蛋白-肿瘤”药理网络。

1.4 GO、KEGG 富集分析

为进一步分析GA 的抗肿瘤潜在作用机制， 将GA 的潜在抗肿瘤靶蛋白输入DAVID 在线分析系统，将研究对象限定为人，进行GO、KEGG 富集分析，并借助Omicshare 在线平台所得通路构建气泡图。

1.5 蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络构建

在STRING 数据库（www.string-db.org）中，输入GA 的抗肿瘤靶蛋白进行在线分析，研究物质限定为人，数据导出为TSV 格式，随后利用Cytoscape 构建GA 抗肿瘤靶点的PPI 网络。

1.6 分子对接验证

为进一步验证GA 与潜在靶蛋白的结合能力，采用iGEMDOCK 分子软件进行对接分析。 首先，从PDB数据库（www.rcsb.org）中下载GA 相关靶蛋白的晶体结构，并用Autodock Vina 去掉多余的分子、加氢等，将其转换为Pdbpt 格式。 随后，进行对接分析，并使用Pymol 进行作图。

2 结果与分析

2.1 GA 的靶点预测分析

经Super-PRED 数据库中的Target Prediction 模块预测，得到110 个GA 的潜在作用靶蛋白，见表1。 将所得到的110 个靶蛋白，通过CTD 数据库分析，筛选得到56 个与肿瘤相关的靶蛋白和41 种肿瘤类型相关。随后，借助Cytoscape 构建“GA-靶蛋白-肿瘤”网络图进一步对GA、与肿瘤相关靶蛋白及肿瘤类型之间的关系进行可视化分析（如图2 所示）。 这些预测结果表明，GA 在乳腺癌、肝癌、非小细胞肺癌、肠癌等多种肿瘤中具有抑制活性和治疗作用。

表1 甘草酸反向对接结果单位：%

图2 GA-靶蛋白-肿瘤的网络

2.2 肿瘤相关靶蛋白的GO、KEGG 富集分析

使用DAVID 数据库对GA 的56 个抗肿瘤靶蛋白进行GO、KEGG 富集分析。如图3（A）所示，GO 富集结果显示，positive regulation of angiogenesis （正调控血管生成）、transmembrane receptor protein tyrosine kinase activity（蛋白酪氨酸激酶活性）、vascular endothelial growth factor-activated receptor activity（血管内皮生长因子激活受体活性）、positive regulation of ERK1 and ERK2 cascade（ERK1 和ERK2 级联正向调节）等与GA 的关联度较高、P 值较低。 KEGG 富集分析发现，GA 的肿瘤靶蛋白富集于PI3K/AKT、HIF-1、JAK/STAT 等通路（如图3（B）所示）。此外，笔者发现GA 也与EGFR 抑制剂耐药存在关联。上述结果表明，GA 可能通过作用于多靶点、调控多通路发挥抗肿瘤作用。

图3 GA 潜在抗肿瘤靶蛋白的GO 和KEGG 通路富集分析

2.3 肿瘤相关靶蛋白的PPI 分析

将经CTD 数据库筛选后的GA 潜在抗肿瘤靶蛋白输入STRING 数据库， 得到GA 潜在靶蛋白之间的相互作用网络，使用Cytoscape 软件，根据“degree”进行进行PPI 网络绘制和优化。 该网络中含有53 个蛋白（GPR55、HSD17810、CNR2 等3 个蛋白与其他蛋白未发生互作，故未在该网络中显示），159 条边；节点中字体的大小代表“degree”的大小。 因此，由图4 可知，HSP90AA1、mTOR、PI3KR1、STAT3 等蛋白在该网络中占据重要地址，表明这些蛋白可能是GA 的抗肿瘤关键蛋白。

图4 GA 抗肿瘤靶蛋白的蛋白-蛋白互作网络

2.4 GA 与HSP90AA1、mTOR、PI3KR1、STAT3 等靶蛋白的分子对接验证分析

为进一步验证HSP90AA1、mTOR、PI3KR1、STAT3 等靶蛋白是否为GA 的潜在抗肿瘤关键蛋白， 使用iGEMDOCK 分子对接软件进行对接分析。对接结果显示，GA 与HSP90AA1、mTOR、PI3KR1、STAT3 等靶蛋白的结合能分别为：-98.2、-111.7、-132.9、-135.9 kcal·mol-1。

如图5 所示，GA 与HSP90AA1 活性口袋中的ASN51、ILE96、GLY97、ASN105、GLY108 等位点产生氢键或范德华力结合；GA 与PI3KR1 的ARG770、GLU798、ARG852、ASP933 等位点产生结合， 这些位点处于PI3KR1 的功能域之中；GA 与mTOR 的磷酸化活性区域中的ILE2163、LYS2171、VAL2183、TRP2239、PHE2184 等氨基酸产生作用；GA 与STAT3 的SH2 区域产生结合， 结合位点为LYS591、SER611、GLU612、SER613、THR620 等。 这些结果说明GA 与HSP90AA1、mTOR、PI3KR1、STAT3 等有很好的结合，且对接结果与反向对接预测相一致。

图5 GA 与潜在抗肿瘤靶蛋白的分子对接验证

3 讨论

近年来，GA 的抗肿瘤活性和作用机制不断被发现。Wang 等人发现GA 在结肠癌细胞中可有效抑制细胞增殖，并诱导细胞凋亡[8]。 Tsai 等在肝癌体内外研究中证实GA 通过抑制PKB 诱导凋亡[6]。 上述研究显示了GA 在抗肿瘤治疗中的潜在应用价值，但其作用机制和潜在作用靶蛋白仍有待深入。 由此，文中通过网络药理和分子对接验证发现，HSP90AA1、MTOR、PI3KR1、STAT3 等可能是GA 抗肿瘤的关键靶蛋白。

HSP90AA1 是热激蛋白（Heat shock protein，HSP）家族的重要成员之一，其在诸如肺癌、乳腺癌等多种肿瘤中存在高表达，是肿瘤检测和治疗的重要靶点之一[9-10]。 Xiao 等在骨肉瘤细胞中发现HSP90AA1 不仅能够调控细胞增殖和转移，还参与调控细胞自噬以及化疗耐药等过程[11]。 HSP90AA1 在肿瘤细胞中的调控作用依赖于下游HIF-1α、AKT 和ERK 等信号通路[12-13]。 结合KEGG、GO 富集结果可以发现GA 可能通过靶向HSP90AA1 调控PI3K/AKT、HIF-1α、ERK 等通路实现抗肿瘤作用。

I3KR1 是磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）的调节亚基p85α，当上游因子与p85α 结合后，将进一步激活PI3K的磷酸化。 Zhang 等人在胃癌中证实miR486-5p 通过负调控PI3KR1 抑制PI3K 磷酸化及其下游因子AKT[14]。 Lin 等研究发现PI3KR1 在三阴性乳腺癌中存在着高表达，且与AKT3 的磷酸化存在着密切相关性[15]。 GA 的相关药理研究显示，其可通过抑制PI3K/AKT 通路实现抗炎和抗肿瘤作用[16]。 故，PI3KR1 可能是GA 抗肿瘤作用靶蛋白之一。

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（Mammalian target of rapamycin，mTOR），属非典型高保守丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶， 具有调控细胞的增殖、 生长、 自噬等作用。 在哺乳动物中，mTOR 主要有两种存在形式：mTORC1 和mTORC2，但mTOR 的大部分功能来自于mTORC1。当上游因子AKT 活化后，磷酸化TSC2 使TSC1-TSC2 复合物解离，从而激活mTORC1，进而磷酸化真核翻译起始因子4E 结合蛋白1（4EBP1）、S6 激酶（S6K） 和固醇调节元件结合蛋白（SREBP），以促进蛋白质翻译，并抑制自噬过程。此外，Son 等还发现mTORC1 的酰基化也能调控自噬过程[17]。 因此，mTOR 成为抗肿瘤药物筛选的重要靶点之一。 Wang 等发现二甲双胍通过抑制mTORC1 和mTORC2 双通路实现诱导自噬和细胞周期阻滞[18]。Allen 通过计算机高通量筛选发现桂利嗪和氢化嗪类化合物是mTORC1 的潜在抑制剂[19]。 研究结果表明，GA 能与mTORC1 产生结合，进而发挥抗肿瘤作用。

信号转导和转录激活子3（signal transducers and activators of transcription 3，STAT3），位于人17 号染色体q21.2，由约750～850 个氨基酸组成，包含：DNA 结合域（DBD）、SH2 结构域、羧基端转录激活区域等功能结构域。 临床病理研究显示，其在多种恶性肿瘤中存在高表达、高活性。 因此，STAT3 被认为是肿瘤诊疗、发病机制、治疗药物开发等领域的重要因子之一[20]。 针对STAT3 抑制剂的开发和找寻主要集中于上游信号因子的阻断，或直接针对性抑制其SH2、DBD 等功能域或抑制其的表达等方面。 红景天苷被证明通过与STAT3的DBD 结合，从而阻断STAT3 与Nanog、MMP2 等基因的启动子的结合而发挥其抗三阴性乳腺癌的活性[21]。此外，抑制STAT3 的乙酰化也成为STAT3 抑制剂开发的新思路。 如，一种新合成的咔唑——SH-I-14，通过抑制STAT3 乙酰化，破坏DNMT1-STAT3 相互作用，导致DNA 去甲基化和肿瘤抑制基因的重新表达[22]。 分子对接结果显示，GA 可能是STAT3 的潜在抑制剂，其与STAT3 的SH2 区域产生结合，进而抑制STAT3 磷酸化。

4 结语

论文利用网络药理学相关方法深入分析了GA 抗肿瘤的潜在作用机制和作用靶蛋白， 结果表明GA 可作为治疗多种实体肿瘤的潜在药物。该研究为GA 的药理研究、临床应用提供了重要的理论参考，也为以GA为先导物的靶向抗肿瘤药物的开发提供了一定的技术支撑。