蚕蛹虫草栽培方法优化试验*

李海洲，陈正余，王小平，孙新涛，贺才厚

（1.安康市蚕桑产业发展中心，陕西 安康 725000；2.西北农林科技大学，陕西 杨凌 712100）

蛹虫草 (Cordyceps militaris） 有特殊的营养价值，如虫草酸、虫草素、虫草多糖、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD）、硒等，故其也具有明显的药用价值[1]。蛹虫草的药理成分和作用与野生冬虫夏草（Ophiocordyceps sinensis） 相近，都能提高机体免疫功能，明显降低血清胆固醇，还有雄性激素样作用及镇静功效，但价格仅为野生冬虫夏草的1/10，是野生冬虫夏草的理想替代品[2]。蛹虫草作为补益类中药，其药效成分及生物学活性研究已有几十年的历史，且应用越来越广泛[3]。蚕蛹虫草既可食用也可药用，并且食用方法便捷，泡酒、泡茶、煮炖均可。随着人民生活水平的提高和饮食结构的调整，蚕蛹虫草已成为人们餐桌上的美味佳肴和常用保健食品。2009 年，卫生部批准蛹虫草为新资源食品，在未来的功能性食品和保健性食品开发中具备较大潜力。近年来，因野生蚕蛹虫草资源日渐匮乏，因此人工栽培的蚕蛹虫草以良好的保健功效深受欢迎，需求量逐年上涨，使蚕蛹虫草栽培业具有更加广阔的发展空间。

人工栽培蚕蛹虫草，是用蚕蛹虫草菌种浸染蛹体，菌种从蛹体内吸取养分而迅速增殖，约半个月菌丝即长满蛹体，随后蛹体僵硬最终形成僵蛹。通过人工诱导，约1 周即在蛹体的头、胸、腹各环节间膜处形成许多子实体原基，再经约10 d 子实体即成熟[4]。虽然蚕蛹虫草的人工培养在我国已获得成功并进入产业化阶段，但生产中仍存在许多难题，较突出的就是蚕蛹虫草菌种退化的问题。因为蚕蛹虫草的生长机制及所需生态环境与一般食用菌不同，长期进行无性繁殖及多次转管的菌种，其母种基因容易变异，表现为子实体畸形甚至无法产生子实体，产量和品质均不稳定，生物转化率较低[5]。这给批量栽培带来极大的风险。因此获取适应性强、子实体产量高的菌种是蚕蛹虫草栽培成功的关键因素[6]。蚕蛹虫草生长需要的营养成分有碳、氮、矿物质元素、维生素等，不同成分和含量的营养物质对虫草的产量和品质有明显影响。营养成分配比不当会造成蚕蛹虫草子实体生长推迟，严重时甚至无法产生子实体，因此需要根据蚕蛹虫草的生长特性筛选适合的液体菌种培养基配方，保证培养基营养均衡。同时，蚕蛹虫草的寄主是活体蚕蛹，具有一定的抗菌性，选择不同的接种方法对蚕蛹感菌、僵化、转色子实体形成等的效果都有决定性作用，需要对不同接种方法进行试验，以筛选出最优的接种方法。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 蚕蛹虫草菌株

菌株1（C1）：子实体采自安康汉阴凤凰山，菌株由孢子分离获得。

菌株2（C2）：子实体采自安康汉滨双龙镇，菌株由孢子分离获得。

菌株3（C3）：菌株来自中国科学院微生物研究所，菌种编号为3.4655。

1.1.2 主要试剂

葡萄糖（AR） 500 g，天津市北辰方正试剂厂；蔗糖（AR） 500 g，天津市北辰方正试剂厂；磷酸二氢钾（AR） 500 g，天津市化学试剂三厂；硫酸镁（AR） 500 g，天津市北辰方正试剂厂；蛋白胨，北京鸿润宝顺科技有限公司；维生素B1、B6，天津市光复精细化工研究所；酵母粉，北京鸿润宝顺科技有限公司；增产灵，江苏省江都市天达食用菌研究所；土豆、玉米粉、食用油、食盐，均为市售。

蚕蛹粉，新鲜蚕蛹经60 ℃烘干后粉碎而成；营养强化剂，每1 000 克含酵母粉10 g、葡萄糖20 g、维生素B14 片、维生素B64 片。

1.1.3 液体培养基配方

液体菌种培养基配方F1：300 g 土豆去皮切片，加清水1 000 mL 煮沸后取滤液备用；称取葡萄糖20 g、蛋白胨2 g、磷酸二氢钾0.5 g、硫酸镁1 g、食盐1 g、维生素B115 mg，加入土豆滤出液中搅拌均匀；加入纯净水定容至1 000 mL。将培养液分装入容积为500 mL 的锥形瓶，每瓶约300 mL，并加入2～3 滴食用油（防止通气培养时产生泡沫），用脱脂棉封口。121 ℃高压灭菌30 min，冷却到30 ℃以下备用。

液体菌种培养基配方F2：称取葡萄糖20 g、蛋白胨10 g、玉米粉20 g、酵母粉5 g、磷酸二氢钾10 g、硫酸镁0.5 g、维生素B13 片，加纯净水定容至1 000 mL，分装入容积为500 mL 的锥形瓶中，每瓶约300 mL，加入2～3 滴食用油（防止通气培养时产生泡沫），用脱脂棉封口。121 ℃高压灭菌30 min，冷却到30 ℃以下备用。

液体菌种培养基配方F3：200 g 土豆去皮切片，加清水1 000 mL 煮沸后取滤液备用；取蔗糖20 g、磷酸二氢钾3 g、硫酸镁1.5 g、维生素B12 片、增产灵0.5 mg，加纯净水定容至1 000 mL，分装入容积为500 mL 的锥形瓶中，每瓶约300 mL，加入2～3滴食用油（防止通气培养时产生泡沫），用脱脂棉封口。121 ℃高压灭菌30 min，冷却到30 ℃以下备用。

1.1.4 主要仪器设备

LDZX-30KBS 型立式压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂；HWS-160 型智能恒温恒湿箱，宁波东南仪器有限公司；YC-D205 超声波加湿器，北京亚都环保科技股份有限公司；ACS-25S 电子秤，上海衡器总厂；KB-900 智能脱色摇床，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；1810D 型自动双重纯水蒸馏器，上海申生科技有限公司；WJ-JZX 无菌接种箱，济南洁康空气净化设备厂；DHG-9075A 电热恒温鼓风干燥箱，上海齐欣科学仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种筛选试验

将野生蚕蛹虫草菌种C1、C2，以及引入的蚕蛹虫草菌种C3 进行活化，分别接种至F1 配方的液体培养基中制备成液体菌种，随后进行菌株筛选试验。取30 个蚕蛹虫草栽培罐（瓶），分为3 组，每组10个，每罐（瓶） 包含25 个蚕蛹。将3 种蚕蛹虫草液体菌种以注射的方式分别接种至蚕蛹中，每个蚕蛹菌种接种量为0.2 mL，将接种了不同菌种的试验组分别记为C1、C2、C3。通过观察蚕蛹感染后变僵和子实体形成过程，根据相应参数及菌株活性，确定最优菌种。

1.2.2 液体菌种培养基配方的优化试验

液体菌种的制备方法。在灭菌的接种箱内，按无菌操作的要求分别在3 种液体培养基中接入试管母种，每瓶接入5 mm×5 mm 大小的C3 菌种4 块，并加入5～6 粒小玻璃珠或洁净沙石（可使菌球分布更均匀）。随后将培养瓶置于转速为80～120 r·min-1的摇床上，在22～25 ℃条件下震荡培养5～7 d，待菌球直径达0.3～1.0 mm 或菌球充满液体培养基时，即液体菌种制作完成。

取30 个蚕蛹虫草栽培盒，分为3 组，每组10个，每盒准确加入320 g 优质大米、蚕蛹粉2 g、营养强化剂430 mL，聚乙烯薄膜封口，121 ℃高压灭菌30 min，冷却到30 ℃以下备用。将3 种配方制备的蚕蛹虫草液体菌种分别接种到大米复合培养基中，将不同培养基配方的试验组记为F1、F2、F3。完成接种后将栽培盒至于温度为16 ℃、湿度为65%的条件下黑暗培养14 d。观察菌种在培养基中的生长情况，确定液体培养基的配方。

1.2.3 接种方法优化试验

以蚕蛹为寄主，分别采用喷洒（P1）、浸泡（P2）、注射（P3） 3 种方式接种优选的蚕蛹虫草液体菌种（即菌种为C3，液体培养基配方为F1），观察其发菌情况，确定最优接种方法。

取30 个蚕蛹虫草栽培罐（瓶），分为3 组，每组10 个，分别采用喷洒、浸泡、注射3 种方式接种蚕蛹，每种方法接种10 罐（瓶），每罐（瓶） 25 个，通过对比试验观察蚕蛹变僵情况，确定最优接种方法。

2 结果及分析

2.1 菌种筛选试验结果

各试验组中蚕蛹蛹体变僵硬、出现白色菌丝、出现芽孢、芽孢见光转黄色、子实体形成等情况详见表1。

表1 蚕蛹虫草菌株活性对照表Tab.1 Comparison table of Cordyceps militaris strains

由表1 可知，C1 和C3 接种后的感菌率都在80%以上，C2 的感菌率为78.4%；在5～8 ℃的温差刺激后，3 个菌株形成子实体所占比率分别为78.1%、82.6%、80.3%，C1 菌株的子实体形成率低于C2 和C3；感光转色率分别为93.7%、93.8%、95.7%，3 个菌株的转色率都达到92%以上，转色好；3 个菌株在转色后子实体的生长情况均良好。

综合考虑，C3 菌株接种后，感菌率、子实体形成率、转色率都达到80%以上。C3 菌株接种后的生长情况见图1。

图1 C3 菌株子实体形成过程Fig.1 The formation process of fruit body of C3 strain

由图1 所示，C3 菌株性状稳定、成功率较高，因此选择C3 为最优的蚕蛹虫草菌种。

筛选出的菌种栽培一段时间后，为防止菌种退化，必须进行分离纯化。对已经开始退化的菌种要定期进行复壮，尽可能保持菌种原有性状和活力的稳定，确保菌种不变异。

2.2 液体菌种培养基配方筛选试验结果

各液体菌种培养基表面白色菌丝形成（感菌）情况见图2，各配方条件下菌种在大米培养基上形成的子实体见图3。

图2 蚕蛹虫草液体菌种培养基配方筛选试验对照图Fig.2 Comparison chart for screening test of liquid spawn for Cordyceps militaris

图3 蛹虫草在大米培养基上形成的子实体Fig.3 Fruit body formed by Cordyoeps mtlttarts on rice culture-medium

由图2 和图3 可知，液体菌种培养基配方F1 具有发菌快，感菌率高的优点。配方F1 确定为最优配方。

2.3 接种方法筛选试验结果

接种方法筛选试验情况见图4。

图4 蚕蛹虫草接种方法筛选试验对照图Fig.4 Comparison chart of screening test for inoculation methods of Cordyceps militaris

由图4 可知，采用喷洒及浸泡的方式接种蚕蛹，蚕蛹感菌率极低，不宜采用。注射接种法接种后蚕蛹感染变僵率较高，因此接种推荐采用注射法。

3 结论及讨论

试验以感菌率高、子实体整齐、转色发菌快、菌丝长势好的3 种优良菌种为对象，通过菌种生长活性对比试验，筛选出最优菌种。蚕蛹虫草人工栽培中常用的碳源有葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉、果胶等，其中以葡萄糖、蔗糖等小分子糖类的利用效果最好；蚕蛹虫草能利用的有机氮类很多，其中氨基酸、蛋白胨、豆饼粉、蚕蛹粉、酵母膏等利用效果最好；蚕蛹虫草所需矿物质元素以磷、钾、钙、镁等为主，加入B 族维生素有利于蚕蛹虫草菌丝的生长和发育[7]。用无菌注射器吸取液体菌种进行注射接种效果最好，液体菌种接种量以0.2 mL 为宜，全过程按无菌操作要求进行[8]。

通过对蚕蛹虫草菌种、液体培养基配方、接种方法3 个因素进行对比试验，以接种后蚕蛹感菌率、子实体整齐度、转色情况、菌丝长势为评价指标，筛选出感菌率、子实体形成率、转色率都达到80%以上，性状稳定的蚕蛹虫草菌种C3。通过液体菌种培养基配方筛选试验，筛选出发菌快的液体菌种培养基配方F1。分别采用喷洒、浸泡、注射的方式接种蚕蛹虫草液体菌种，喷洒及浸泡方式虽然操作相对简单，但蚕蛹感菌率极低，而注射接种法接种后蚕蛹感染变僵率达到80%以上，因此注射为最优的接种方法。