秀珍菇富硒菌株筛选及其子实体富硒规律研究*

陈雪凤，刘增亮，吴圣进**，张雯龙，祁亮亮，潘庆流

（1.广西农业科学院微生物研究所，广西 南宁 530007；2.河池市宜州区农业科学研究所，广西 河池 546300）

食用菌是良好的硒元素转化载体，能够将环境中的无机硒转化为安全高效的有机硒，在开发富硒农产产品中具有巨大的潜力[1]。秀珍菇（Pleurotus pulmonarius） 是近年来发展较迅速的食用菌品种，规模化栽培程度高，出菇整齐，产量高，且硒有机化程度高，在开发富硒秀珍菇方面具有巨大的前景。

近年，广西利用本土富硒原料栽培富硒秀珍菇取得了很好的效果，但本研究团队在实际生产中发现，秀珍菇子实体硒含量除主要受栽培原料的硒含量影响外，还会受菌株本身的富硒能力、菌棒菌龄和子实体生育期的影响。而国内有关富硒秀珍菇的研究主要集中在利用富硒栽培原料（培养液） 栽培或菌种发酵技术培养[2-3]，添加不同浓度外源硒对秀珍菇的菌丝生长、产量、子实体硒含量、品质等方面的研究[4-8]。目前，对富硒秀珍菇菌株的系统筛选及秀珍菇子实体对硒富集规律研究少有报道。

因此，通过对适合工厂化栽培的10 个低温刺激型秀珍菇菌株的耐硒水平、富硒能力、栽培出菇性状开展试验，筛选出富硒能力较高、产量稳定且综合性状较好的菌株并掌握其子实体富硒规律，为富硒秀珍菇栽培种源选择及高质量富硒秀珍菇栽培提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株

供试的10 株低温刺激型秀珍菇菌株均为广西工厂化栽培品种，由广西农业科学院微生物研究所保存并提供，具体信息见表1。

表1 供试秀珍菇菌株信息Tab.1 The information of tested Pleurotus pulmonarius strain

表1 中的10 个菌株经耐硒水平、富硒水平及栽培性状测试后，筛选获得的富硒菌株再用于子实体富硒规律研究。

1.1.2 供试培养基

PDA 综合培养基配方：土豆200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、七水硫酸镁2 g、磷酸二氢钾2 g，蒸馏水1 000 mL，pH 自然。

液体发酵培养基配方：土豆200 g、七水硫酸镁2 g、葡萄糖20 g、磷酸二氢钾2 g，蒸馏水为1 000 mL，pH 自然。

栽培出菇培养基配方：桑枝屑40%、杂木屑40%、麦麸18%、石灰2%，添加适量硒肥后检测原料总硒含量为3.20 mg·kg-1。

1.2 菌棒制作和出菇管理方法

按1.1.2 栽培出菇培养基配方称取原料。桑枝屑和杂木屑提前1 d 预湿，次日拌料时加入辅料，充分搅拌均匀。培养料含水量约63%，pH 为7～8，每袋干料质量为0.5～0.6 kg。按常规方法进行制袋，灭菌，接种。接种后，菌棒置于同一培养大棚中，在25～28 ℃下培养。菌丝达到生理成熟时，挑选出菌丝生长良好的菌包移入出菇棚，在同一条件下出菇。使用降温设备对菌棒进行低温刺激，10 ℃低温维持12～14 h 催蕾出菇，按常规方法进行出菇管理。

1.3 富硒菌株筛选方法

1.3.1 秀珍菇菌株耐硒水平测试

在1.1.2 的PDA 综合培养基中分别添加0（CK1）、20.0、40.0、60.0、80.0 和100.0 mg·L-1的Na2SeO3，制成不同浓度Na2SeO3固体培养基，从20.0 mg·L-1起，依次命名为A1～E1；将供试菌株的菌丝圆片（Ф＝0.6 cm） 分别接种到不同浓度Na2SeO3固体培养基上，每处理3 个重复，接种后统一置于28 ℃恒温培养。培养1～2 d 菌丝萌发生长至直径为1.0 cm 时划起始线，待生长最快的菌株菌丝长到即将满皿时，在所有菌株的菌落边缘划终止线，观察菌丝生长状态并计算菌丝生长速率。菌丝生长速率（mm·d-1） 为2 次划线之间菌丝生长的长度（mm）除以培养时间（d）。

1.3.2 秀珍菇菌株硒富集水平测试

在1.1.2 的液体发酵培养基中分别添加0（CK2）、1.0、2.5、5.0 和10.0 mg·L-1的Na2SeO3，制成不同浓度Na2SeO3液体培养基，从1.0 mg·L-1起，依次命名为A2～D2；用250 mL 三角瓶盛装，每瓶装液量为100 mL。分别接入5 个活化好的供试秀珍菇菌株菌丝圆片（Ф＝0.6 cm），每处理3 个重复，接种后于28 ℃静置培养1 d，然后以28 ℃、160 r·min-1振荡培养14 d。培养结束后每个处理分别用100 目纱网过滤收集菌丝，然后用700 mL 去离子水清洗菌丝，再用100 目纱网过滤，按此法清洗3 次。清洗结束后，收集的菌丝挤干水分，放入干燥箱中烘干，干菌丝样品用于硒含量测定。

1.3.3 秀珍菇菌株栽培出菇性状测试

按照1.2 的方法制作菌棒和出菇管理，菌棒冷却后分别接入供试菌株菌种，每个菌株设3 个重复，接种后观察记录菌丝生长情况。每个重复随机抽取30 袋测定菌丝生长长度，即当菌丝定植（吃料） 2～3 cm 时在菌丝生长前端划线，菌丝快满袋时再次划线，菌丝生长速率（mm·d-1） 为2 次划线之间菌丝生长长度（mm） 除以菌丝生长天数（d）。出菇时，观察第1 潮出菇情况及黄斑病病害发生程度，统计前3 潮商品菇产量，计算生物学效率（%），即为鲜菇质量除以干料质量乘以100%。抽取第1 潮子实体进行烘干，送样检测硒含量。主要根据第1 潮子实体的硒含量、产量（即生物学效率）、黄斑病发生程度来考量，选出富硒优良菌株。

1.4 子实体硒富集规律分析

1.4.1 菌龄对子实体硒富集的影响

按照1.2 的方法制作菌棒，接入1.3 筛选得到的富硒秀珍菇菌株，菌棒培养80 d 进行第1 潮出菇，此后养菌20 d 进行下一潮出菇，共养菌出菇6 潮，即菌棒菌龄为80 d（第1 潮）、100 d（第2 潮）、120 d（第3 潮）、140 d（第4 潮）、160 d（第5潮）、180 d（第6 潮）。每潮出菇后，子实体达八成熟（菌盖边缘内卷，直径约3.0～5.0 cm） 时采收，每处理随机抽取鲜菇样品并烘干，然后进行硒含量检测分析。

1.4.2 子实体不同部位对硒富集的影响

按1.3 方法生产的富硒菌株菌棒出菇后采收第1潮，随机抽取鲜菇样品，将鲜菇样品的菌柄和菌盖分别剪下，烘干后检测硒含量。

1.4.3 子实体不同生育期对硒富集的影响

按1.3 方法生产的富硒菌株菌棒在第1 潮出菇时，分别在菇蕾期（菌盖直径＜1 cm）、小菇期（菌盖直径2.0～2.5 cm）、子实体八成熟期（菌盖边缘内卷，直径约3.0～5.0 cm） 和子实体老熟期（子实体边缘开始上卷，菌盖直径＞5 cm） 采摘子实体，每个生育期分别采集样品并烘干，检测硒含量。

1.4.4 菌丝和子实体烘干处理及硒含量检测

将收集的菌丝和子实体样品在45～50 ℃下烘干，采用《食品安全国家标准食品中硒的测定》（GB 5009.93-2017）[9]的方法进行硒含量检测分析。

1.5 统计分析

试验数据采用DPS 7.0 进行处理，以Tukey 法进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 富硒菌株筛选试验结果

2.1.1 秀珍菇菌株耐硒水平试验结果

10 个秀珍菇菌株在添加不同含量Na2SeO3的固体培养基上的生长情况见表2。

表2 秀珍菇在添加不同含量Na2SeO3 的固体培养基中的生长情况比较Tab.2 Growth of Pleurotus pulmonarius on solid medium with different contents of Na2SeO3

由表2 可知，10 个低温刺激型秀珍菇菌株在0～100.0 mg·L-1Na2SeO3固体培养基中均可生长，说明秀珍菇在固体培养基上的耐硒能力较强。其中，秀珍188 和秀珍195 的菌丝在0～80.0 mg·L-1Na2SeO3固体培养基中生长健壮，整齐浓密，生长速率分别为8.71～9.15 mm·d-1和8.49～9.27 mm·d-1，且各处理间差异不显著，但总体上均高于其他相应处理的菌株；在100.0 mg·L-1处理中的菌丝生长速率虽然显著或极显著低于0～80.0 mg·L-1各处理，不但菌丝仍然健壮浓密，而且生长速率还能保持在8.08 mm·d-1和7.38 mm·d-1，均明显高于100.0 mg·L-1处理的其他菌株，说明秀珍188 和秀珍195 对硒的耐受能力强于其他菌株。永州6 号在0～80.0 mg·L-1的Na2SeO3固体培养基中菌丝生长健壮浓密，各处理中菌丝的生长速率差异不显著，但在100.0 mg·L-1处理中生长速率明显下降，长势减弱，说明永州6 号也具有较强的耐硒能力。其余7 个菌株的菌丝仅在Na2SeO3含量小于80.0 mg·L-1的固体培养基中长势好；当含量大于80.0 mg·L-1时，菌丝长势明显减弱，菌丝生长速率明显下降，说明这7 个菌株的耐硒能力较弱。可见，秀珍188、秀珍195 和永州6 号为试验条件内耐硒能力较强的菌株。

2.1.2 秀珍菇菌株硒富集水平试验结果

10 个秀珍菇菌株在添加不同含量Na2SeO3的液体发酵培养基中培养后，其干菌丝中硒含量的检测结果见表3。

表3 添加不同含量Na2SeO3 的液体发酵培养基培养后秀珍菇干菌丝中硒含量Tab.3 Selenium content in the dried mycelium of Pleurotus pulmonarius after culture in liquid fermentation medium with different contents of Na2SeO3

由表3 可知，秀珍菇干菌丝硒含量均随着液体发酵培养基中Na2SeO3质量浓度的增加而提高，说明干菌丝硒含量与液体培养基中硒的浓度呈正比关系。在0～5.0 mg·L-1的Na2SeO3处理中，永州6 号菌株干菌丝硒含量分别为2.62、314.19、939.94 和2 033.43 mg·kg-1，均极显著高于相应处理的其他菌株，说明永州6 号在0～5.0 mg·L-1的Na2SeO3液体发酵条件下对硒的富集能力最强。秀珍P-6 菌株干菌丝的硒含量在10.0 mg·L-1的Na2SeO3处理中达到2 760.00 mg·kg-1，极显著高于其他9 个菌株干菌丝硒含量2～3 倍，说明秀珍P-6 菌株在该条件下富硒作用最强；在对照组液体发酵培养基（Na2SeO3质量浓度为0） 中培养后，秀珍P-6 菌株干菌丝硒含量为1.88 mg·kg-1，仅次于永州6 号，极显著高于其他7个菌株。台秀57 菌株干菌丝硒含量在1.0～10.0 mg·L-1的Na2SeO3处理中均较高，其中2.5、5.0 mg·L-1处理的干菌丝硒含量分别为429.08、1 360.42 mg·kg-1，仅次于永州6 号，说明其富硒能力也较强。除永州6号、台秀57 和秀珍p-6 菌株外，其他7 株菌株仅在个别Na2SeO3处理下表现较好。因此，依据菌株菌丝在0～10.0 mg·L-1的Na2SeO3液体发酵培养基中对硒的富集水平，筛选出富硒能力较高的菌株为永州6号、秀珍P-6 和台秀57。

2.1.3 秀珍菇菌株富硒栽培出菇性状表现

使用添加硒肥的栽培出菇培养基（总硒含量为3.20 mg·kg-1） 栽培秀珍菇，10 个菌株的出菇情况见表4。

表4 富硒栽培秀珍菇的出菇情况Tab.4 Fruiting condition of selenium-enriched cultivated Pleurotus pulmonarius

由表4 可知，利用硒含量为3.20 mg·kg-1的栽培基质进行秀珍菇栽培，10 个菌株中前3 潮生物学效率较高的是台秀86、台秀57 和永州6 号，分别为50.32%、49.73%和48.82%，三者间差异不显著，但极显著高于其他7 个菌株，说明这3 株为高产菌株。

子实体硒含量最高的是广温秀珍和秀珍195，分别为12.63、12.04 mg·kg-1，显著高于其他8 株菌株，说明广温秀珍和秀珍195 在栽培出菇中富硒能力最强，但子实体产量较低；永州6 号和秀珍P-6 的子实体硒含量分别为11.52、11.41 mg·kg-1，与广温秀珍和秀珍195 无显著差异，但显著高于其余6 株菌株。

从第1 潮菇黄斑病发生程度来看，台秀天达和金秀为轻度；其次是永州6 号、台秀57 和台秀86菌株，表现为中度；秀珍p-6、高温秀珍、广温秀珍、秀珍195 和秀珍188 菌株表现为严重。从出菇整齐度来看，只有金秀和广温秀珍出菇不整齐，其他8 个菌株均出菇快而整齐。10 株菌株的菌丝在栽培基质中均生长浓密、健壮。永州6 号、金秀和秀珍188 菌株的菌丝生长速率较高，为5.29 ～5.36 mm·d-1，除显著或极显著高于台秀天达菌株外，与其他菌株均无显著差异。

综上所述，通过考量生物学效率（产量）、子实体硒含量、黄斑病发生程度、出菇快慢及整齐度（菌丝生长速率），筛选出综合表现较好的菌株为永州6 号，并利用其进行子实体硒富集规律研究。

2.2 秀珍菇子实体硒富集规律比较

2.2.1 不同菌龄菌棒的秀珍菇子实体的富硒能力

以不同菌龄菌棒中采收的永州6 号八成熟子实体为样品，检测子实体硒含量，结果见图1。

图1 不同菌龄菌棒的秀珍菇子实体硒含量比较Fig.1 Comparison of selenium content in fruit bodies of Pleurotus pulmonarius harvested from rods with different ages

由图1 可知，菌棒菌龄为80～140 d 时，子实体的硒含量随着菌龄的增长而提高；当菌棒菌龄达140 d 时子实体硒含量最高，为13.61 mg·kg-1；随着菌棒菌龄增加，140 d 后子实体硒含量开始降低。经方差分析，菌龄为140 d、160 d 的2 个处理子实体硒含量差异不显著，与80 d、100 d、180 d 比较差异极显著，但与120 d 的比较只是差异显著。由此可见，秀珍菇菌棒菌龄在120～160 d 时，子实体对硒的富集水平最高。

2.2.2 子实体不同部位的硒富集水平

检测永州6 号子实体不同部位的硒含量，结果见图2。

图2 秀珍菇子实体不同部位的硒含量比较Fig.2 Comparison of selenium content in different parts of Pleurotus pulmonarius fruit body

从图2 可看出，秀珍菇子实体的硒含量菌盖＞菌柄；菌盖硒含量是菌柄硒含量的1.41 倍，二者差异极显著。说明对于硒的富集，菌盖比菌柄具有顶端优势。

2.2.3 不同生长发育期的秀珍菇子实体硒富集水平

检测不同生长发育时期的永州6 号子实体硒含量，结果见图3。

图3 不同生长发育期的秀珍菇子实体硒含量比较Fig.3 Comparison of selenium content in fruit bodies of Pleurotus pulmonarius at different growth stages

从图3 可看出，不同生长发育时期的秀珍菇子实体硒富集规律表现为菇蕾＞小菇＞八成熟菇＞老熟菇。菇蕾期子实体的硒含量最高，为9.78 mg·kg-1，极显著高于与其他生育期；小菇期和成熟菇期子实体硒含量分别为8.40、8.17 mg·kg-1，二者差异显著；老熟子实体硒含量仅7.51 mg·kg-1，极显著低于其他生育期。可见，随着子实体的不断长大成熟，其吸收转化的硒不断降低。

3 讨论与结论

张正伟[10]研究发现，一些香菇品种的菌丝体富硒能力与子实体富硒能力不同，本试验中也发现有些秀珍菇菌株的菌丝富硒能力与子实体存在差异。其中，广温秀珍和秀珍195 在液体培养中菌丝体的硒含量较低，但栽培获得的子实体硒含量较高；台秀57 在液体培养中菌丝体的硒含量较高，但栽培获得的子实体硒含量较低。可见，在液体培养中菌丝富硒能力强的菌株，在栽培中不一定是子实体富硒能力强的菌株。沈恒胜等[8]研究中只测试3 株菌株的菌丝在液体培养基中的富硒水平，未进行栽培出菇子实体富硒水平测试，因此，筛选获得的菌丝富硒能力强的秀珍菇菌株不一定是栽培中富硒能力强的菌株。此次试验综合测试了菌株菌丝的耐硒能力、富硒能力、子实体富硒能力及产量等多方面，更全面地筛选出的富硒菌株，利于推广应用。

食用菌菌龄不仅会影响菌丝生长和出菇产量，也会影响菌丝对硒的吸收转化。陈启才等[11]、陈雪凤等[12]研究发现，秀珍菇前3 潮子实体的硒含量随着出菇潮次数的增加而增加。此次试验结果表明，菌棒菌龄在80～140 d 的永州6 号菌株，其前4 潮子实体的硒含量随着菌棒菌龄（或潮次） 而增加，说明菌棒菌龄（菌丝生长周期） 对硒的吸收转化具有较大影响，与上述研究结果一致。此次仅在广西气温较低的1 月至2 月间对永州6 号菌棒（单头接固体种） 进行常规条件培养，菌棒生长慢，菌丝生长周期相对长，在菌棒菌龄为80 d 时开始出第1 潮菇，富硒能力最强的时期为菌棒菌龄120～160 d。因此，还需继续探究其在其他培养时间或环境条件下富硒能力最强的菌龄。

张正伟[10]、祝传望等[13]、李华为等[14]在研究香菇（Lentinula edodes）、平菇（Pleurotus ostreatus）、金针菇（Flammulina velutipes） 子实体各部位的硒含量分布时，得出菌盖硒的含量高于菌柄。此次试验结果表明，永州6 号秀珍菇菌盖硒的含量也高于菌柄，与上述研究结果一致，说明秀珍菇子实体对硒的富集具有顶端优势，因此，在富硒秀珍菇栽培生产中应在出菇管理时促进菌盖生长。

本试验中，不同生长发育时期的永州6 号秀珍菇子实体硒富集表现为菇蕾＞小菇＞成熟菇（菌盖直径3.0～4.0 cm） ＞老熟菇的规律。虽然菇蕾和小菇的硒含量高，但菇体太小，这2 个时期采摘会严重影响产量；而子实体过于老熟时，硒含量降低且品质下降，因此，秀珍菇的子实体在成熟菇采收较为适宜。

综合分析10 个低温刺激型秀珍菇的耐硒水平、富硒水平及栽培出菇效果，筛选出综合表现较好的富硒菌株为永州6 号。永州6 号菌株菌棒的菌龄为120～160 d 时，其子实体的硒含量较高且稳定，其菌盖富硒能力集水平高于菌柄，菇蕾期子实体硒含量最高。永州6 号菌株可在栽培生产中推广应用。