土壤中抗生素抗性基因研究进展

陈优,张瑶,肖方景,蔡甲,张强英,布多,崔小梅

(西藏大学 理学院,西藏 拉萨 850000)

抗生素会诱导产生抗生素抗性基因(ARGs),具有在环境中长时间残留、远距离迁移传播等特点,且会造成生物污染[1]。土壤中包含多样化的微生物,更有利于ARGs的产生和扩散,土壤中ARGs的快速富集膨胀会对植物和微生物造成伤害[2]。此外,土壤是ARGs的重要储蓄层和汇,富含的微生物为适应复杂多变的环境,自身携带多种类型的抗性基因,并会产生与抗生素相关的基因[3]。本文综述了土壤环境中抗生素及ARGs的来源及赋存特征,总结分析了土壤中ARGs的传播的影响因素,针对去除土壤环境中的抗性基因的消减技术进行了讨论,最后展望了目前土壤中抗生素及抗性基因存在的问题并提出了相关建议,旨在为土壤ARGs的污染防治提供理论依据。

1 土壤环境中抗生素及抗生素抗性基因的来源和赋存特征

抗生素自1940年在临床上开始使用,有效降低了细菌感染造成的死亡率,增加了人类寿命,但吸收率不高造成大量抗生素进入土壤环境中。2013年抗生素的总使用量为92 700 t,其中约有53 800 t抗生素进入到自然环境且54%排放到土壤环境中。

1.1 来源

土壤中抗生素及ARGs的来源分为内在抗性和外源输入。研究表明,在未使用抗生素的自然环境下,土壤环境中存在着大量由微生物合成的天然抗生素,某些微生物可以通过随机突变产生对某种抗生素的抗性,即获得“内在抗性”。在没有人类活动干扰的北极冻土中检测到抗性基因[4],同样,研究人员对3万年前冻土沉积物进行了宏基因组分析,并检测到β-内酰胺、四环素和糖肽抗生素的耐药性基因[5]。因此,在抗生素被人类广泛应用于临床之前,ARGs已经存在于土壤环境中。

外源输入包括粪便施肥、中水回用、大气干湿沉降等。粪便施肥是动物体内抗生素进入土壤环境的主要方式。畜禽粪便中含有大量的抗性基因,其种类和丰度高于土壤环境中的ARGs水平,进而导致在施用畜禽粪便制备的有机肥后,土壤中的ARGs丰度增加[6]。此外,施用有机肥会增加重金属和无机盐含量,进而改变土壤环境的电导率等其他理化性质,无机盐、重金属与抗生素协同作用会进一步促进土壤中ARGs的累积[7]。长期施用有机肥也会改变微生物群落结构,从而增强土壤微生物的耐药性水平。

畜禽养殖废水、生活污水和医疗废水中存在大量的抗生素及抗性微生物,但目前污水处理工艺无法彻底去除废水中的ARGs,出水中仍有大量残留的ARGs检出,进而排放到土壤中。研究表明持续使用中水灌溉的土壤中可以检测到多种抗生素抗性基因,其丰度和多样性显著增加,且ARGs显著富集,因此再生水灌溉是土壤环境中ARGs的重要来源之一[8]。

另外,大气干湿沉降也是环境中抗生素及抗性基因进入土壤中的途径之一。研究表明陆地上的ARGs会以生物气溶胶形态进入大气环境中,而空气环境中的抗性基因又会以雨雪等干湿沉降的形式返回至陆地进入土壤中,从而促进ARGs在环境中的传播[9]。

1.2 赋存

研究表明中国常见的抗性基因包括喹诺酮类、磺胺类和四环素类 ARGs,并且磺胺类 ARGs比四环素类更稳定[10]。其中,土壤环境中的抗生素及抗性基因种类繁多(表 1),但由于土壤类型的差异,土壤中抗生素及抗性基因的赋存状态也不尽相同。

表1 土壤环境中常见抗生素及抗性基因种类Table 1 Common antibiotics and antibiotic resistance genes in soil environment

1.2.1 不同土地利用类型 土地利用类型可分为自然地类(草地、林地)和人工地类(旱地、水浇地及园地)。研究发现放牧通过影响可移动遗传元件(MGEs)、细菌多样性和细菌群落组成来间接影响ARGs,即可以通过调节草地土壤微生物种群来影响土壤抗性[18]。Song 等[14]在中国原始森林土壤中检测到许多对现代抗生素具有耐药性的ARGs,以抗氨基糖苷和编码失活机制的RNA为主。水浇地通常表现出较高的ARGs积累,因为厌氧条件下可能延长抗生素在土壤中的半衰期,高水分含量也可能阻断从肥料修正土壤到根茎层的接触途径,从而影响ARGs的传播。水浇地-旱地轮作系统中有机肥施用的增加也会导致土壤ARGs急剧增加。此外,土壤中总ARGs的相对丰度因土地利用的不同而存在显著差异,工业和交通地区土壤中总ARGs的相对丰度分别比农业土壤高3个和2个数量级。在中国各地的温室土壤和相应的露天土壤中检测到磺胺类、四环素类和喹诺酮类ARGs,其中温室土壤中的ARGs丰度的平均值高于露天土壤,且两种农业土壤中磺胺类ARGs水平都高于其他类型的土壤[19]。

1.2.2 不同区域土壤环境 不同区域土壤环境中的抗性基因存在明显差异,近期关于中国各地区ARGs检出情况(表2)的研究表明 ,土壤环境中ARGs以四环素类、磺胺类和喹诺酮类抗性基因为主,经济发达的长江三角洲其地区抗性基因的相对丰度明显高于其它地区,华南地区的抗性基因的相对丰度较低,东部地区温室土壤中抗性基因的含量和丰度明显高于西部地区[19]。

表2 中国部分地区土壤环境中检出的抗性基因种类及相对丰度Table 2 Species and relative abundance of ARGs detected in soil environments in Parts of China(copies/16S rRNA genes)

2 土壤环境中抗生素抗性基因传播的影响因素

残留于土壤环境中的抗生素及其选择压力是ARGs转移扩散的主导因素,抗生素的存在促进了ARGs的产生,AGRs与其抗生素的浓度之间存在相关性。但ARGs的迁移转化并不依赖于抗生素,在低浓度抗生素污染及没有抗生素污染的地区也存在ARGs[4-5]。ARGs可以通过水平基因转移(HGT)等方式在细菌间转移,同时微生物群落结构的不同也会影响ARGs的丰度[23]。此外,有机肥料、重金属、土壤类型以及抗生素之间的相互作用也会影响土壤环境中抗性基因的传播。

2.1 有机肥料

有机肥料广义上是指动植物残体及其代谢物,包括无机物(氮、磷、重金属等)和有机物(抗生素、激素、多环芳烃等)。在农业生产过程中,人们经常将动物粪便作为肥料滋养田间作物,以提高土壤肥力[21]。研究表明有机肥处理的土壤中ARGs丰度的增加比无机肥处理的土壤中更显著[24]。

有机肥类型及不同施肥方法会影响土壤中的ARGs。在长期施用粪肥的农田中观察到耐药细菌会随着施肥次数的增多而增多[25]。Qing等[23]证实了动物源性有机肥是ARGs、抗生素耐药细菌(ARB)和MGEs的重要载体。Lin等[26]评估了苏格兰草地上反复施用不同有机肥料对ARGs的影响,结果表明不同肥料处理后,土壤中检测到的大多数ARGs的相对丰度随时间而降低,但多次施加有机肥料会在一定程度上抵消土壤ARGs相对丰度的下降趋势。实验结束时几乎所有土壤的细菌群落与实验开始时的未处理土壤不同,证明施肥可以影响土壤微生物群落进而影响土壤ARGs的丰度。

2.2 土壤理化性质

土壤理化性质能够显著影响土壤中细菌群落结构和功能,细菌群落组成是土壤中ARGs含量的主要决定因素。不同土层的细菌群落结构存在显著差异,部分外源寄主细菌不能在土壤中定位,无法从表层土壤迁移到深层土壤,且细菌多样性通常随着土壤深度的增加而降低[24]。ARGs和共存的细菌类群具有显著的正相关性[27],细菌群落是ARGs垂直迁移的主要驱动因素,且宿主细菌丰度的变化影响了ARGs的分布。Qing等[23]对暴露于不同肥料的土壤中的四环素抗性基因(TRG)进行了研究, 结果表明土壤理化性质是促进施用有机肥的稻田中TRG分布的决定性因素,其中电导率(EC)是施用动物源有机肥料的水稻土中TRG变化的主要驱动因素。施用有机肥能够增加土壤中无机盐和重金属含量来提高EC[7]。EC作为一个非生物胁迫因子,与土壤盐度密切相关,故EC可能重塑ARGs的分布[28]。

2.3 重金属共选择

重金属污染能够影响ARGs的丰度和迁移[29]。重金属不易降解,稳定存在于土壤环境,可能会对土壤中ARGs的产生提供长期的选择压力。重金属和抗生素也可以通过协同抗性机制、交叉抗性机制以及协同调控机制等方式使ARGs产生共选择抗性,重金属含量越高,共选择抗性的产生也越容易。Wang等[30]通过宏基因组分析发现,在高重金属含量的土壤中,ARGs和金属抗性基因(MRGs)普遍同时出现,重金属可能增强了ARGs和MRG的共选择抗性。

2.4 土壤类型

土壤类型通过显著影响土壤性质、细菌丰度和细菌多样性来影响ARGs的类型。Wang 等[7]从黄河三角洲褐土、潮湿土和盐碱土中检测出193个ARGs亚型,其中多重耐药性和氨基糖苷类抗性基因是最普遍的。土壤类型也会影响ARGs的分布和动态影响因素,潮土和盐碱土中的ARGs多样性和相对丰度高于褐土。红土和黑土中ARGs的分布对微生物群落的变化更敏感,而黄土中水平基因转移对ARGs的动态分布贡献更大。此外,土壤中ARGs的相对丰度和粘土含量也有关系[31]。

2.5 其他污染物

人类活动过程中产生了许多新型污染物,比如杀菌剂、农药、微塑料等,这些污染物进入土壤环境中可以促进水平基因转移、增加不同细菌类群之间的遗传物质交换,最终调控抗性基因进化。

杀菌剂可以改变土壤微生物群落结构进而影响ARGs的丰度。研究表明温室培养过程中由于大量使用杀菌剂,造成温室土壤比山地土壤具有更多样性的ARGs,总ARGs的丰度也相应提高[32]。此外,一些杀菌剂可能是温室土壤中ARGs的共选择剂,通过MGEs介导的水平基因转移提高ARGs的丰度。农药也会改变土壤中ARGs的总丰度,会降低水稻土中ARGs的含量,但对根际土壤中ARGs丰度的影响不显著[33]。

微塑料具有较大的比表面积,可以吸附土壤中的抗生素、重金属等污染物,进而提高对ARGs的富集量。相较于传统塑料,可生物降解塑料具有相对较低的物理强度,可能会产生更多的微塑料颗粒,导致ARGs 丰度显著增加[34]。微塑料中水溶性的低分子量聚合物可能作为微生物同化的额外碳源,从而诱导土壤中ARGs进化。

3 土壤环境中抗生素抗性基因的消减技术

目前处理环境介质中抗生素抗性基因的方法主要有微生物处理法、吸附法以及高级氧化法。其中土壤中ARGs的消减技术主要包括好氧堆肥、厌氧消化以及生物炭添加等。好氧堆肥和厌氧消化是畜禽粪便的两种主要处理方法,被认为是减少有机废物中化学和生物危害的一种常见而有效的方法。

3.1 好氧堆肥

好氧堆肥是指通过好氧微生物将各种有机物转化为更稳定和更环保的物质的过程,可以防止ARGs从粪便扩散到农田土壤中,以降低多种污染物的生态风险[35]。研究表明好氧堆肥可以有效减少ARGs的传播和丰度,且工业好氧堆肥比厌氧堆肥效果更好[36]。但在好氧堆肥过程中,更多的ARGs亚型被诱导[37]。高熟粪肥能降低土壤和农作物中ARGs的污染,且土壤中ARGs倾向于向植物根系方向积累[38]。此外,高温堆肥通过减少抗生素耐药质粒和相关宿主细菌的丰度,可以有效地清除抗生素发酵废弃物中的ARGs和相关耐药基因[39]。

3.2 厌氧消化

厌氧消化是指在无氧条件下,有机质被厌氧细菌和兼性菌生物降解的过程。研究表明厌氧消化能有效降低养猪场废水中所有检测到的ARGs[40]。温度不同,去除效率也不一样,其中总ARGs在25,37,55 ℃厌氧处理中显著降低[41]。Wang 等[42]通过不同化学氧化过程和中温厌氧消化处理,来研究废活性污泥处理过程中ARGs丰度和细菌群落进化的控制。结果表明热活化氧酮与中温厌氧消化结合的工艺能使大部分ARGs的绝对丰度降低,总ARGs的绝对丰度也下降。沼液作为动物粪便厌氧消化处理的最终产物,在农业土壤中作为肥料被广泛应用,但研究表明长期施用沼液可显著提高土壤中四环素的浓度,并显著增加土壤中ARGs和ARGs相关细菌的丰度[43],因此厌氧消化处理的农业废弃物的可持续利用需要进一步研究。

3.3 生物炭添加

生物炭(biochar)是一种用于改善土壤的理化性质和微生物特性的土壤改良剂,具有强吸附、可固定土壤中的有机污染物和重金属的能力。研究表明生物炭添加可以显著降低非植被土壤中的ARGs,但对根际和叶际的ARGs没有显著影响[44]。He等[2]针对使用或不使用生物炭的情况,对土壤微观结构进行了研究。结果表明,ARGs在生物炭添加的土壤中会缓慢消散。此外,生物炭改良有助于维持细菌多样性[45]。生物炭也可以通过降低土壤的协同选择压力,控制土壤中ARGs的丰度[46]。

4 总结与展望

随着抗生素的广泛使用,环境中的ARGs的种类和丰度不断增加,并在不同介质中进行广泛传播和扩散,对生态环境和人类健康带来危害。土壤是ARGs的重要储库,但目前关于土壤环境中ARGs的分布特征、传播扩散机制等还没有厘清,对于ARGs消减技术的研究还存在许多不足,所以对于土壤环境中ARGs的研究仍有许多亟待解决的科学问题,该文对进一步深入研究的方向提出以下建议:

(1)不同土壤环境中的抗生素及ARGs的丰度和多样性存在较大差异,需进一步研究不同类型土壤中抗生素及ARGs的分布,明确ARGs与土壤环境因子之间的关系;

(2)土壤环境复杂多变,需要增加对土壤环境中ARGs动态变化过程的关注,进一步探究ARGs的传播机制,特别是对于水平基因转移机制的研究,以及影响水平基因转移机制的各种因素;

(3)复合污染物可能会加速ARGs的扩散与传播,但目前关于复合污染物对ARGs水平基因转移机制影响方面的研究较少,需利用宏基因组学等结合宏蛋白组学、宏转录组学等方法,对土壤环境中复合污染物的传播机制进行深入探究;

(4)亟需加强优化或发展新型高效的ARGs 传播阻断和消减技术,探究土壤中ARGs的动态消减规律及作用机制,控制ARGs的产生和传播。