不同养殖模式克氏原螯虾（Procambarus clarkii）游离氨基酸的主成分分析及综合评价

李鹏鹏，温丽敏，吕经秀，卞 欢，诸永志,*，王道营,4，耿志明，徐为民，张凤翔，姚田玉

（1.江苏省农业科学院农产品加工研究所，江苏 南京 210014；2.江苏大学食品与生物工程学院，江苏 镇江 212013；3.西藏农牧学院食品科学学院，西藏 林芝 860000；4.农业农村部农产品冷链物流技术重点实验室，江苏 南京 210014；5.兴化市现代农业发展服务中心，江苏 泰州 225700）

克氏原螯虾（Procambarus clarkii），又称小龙虾，隶属节肢动物门，甲壳纲，原螯虾属。克氏原螯虾原产于美洲，19世纪初传入我国后在长江流域扩散，近年已成为重要的淡水经济养殖动物[1-2]。克氏原螯虾以其鲜美的口感和丰富的营养，成为中国消费者最喜爱的水产之一[3]。2021年我国小龙虾养殖面积2600万 亩、产量263.36万 t[4]。

水产养殖对世界粮食供应和人类营养安全起着至关重要的作用。目前，我国已经发展了多种生态友好的水产养殖模式，其中水稻-水产（鱼、虾、蟹等）共养系统符合我国的基本农田政策，且由于能合理利用土地空间、作物和水产养殖之间的互惠共生以及满足对食物来源的需求而被公认为可持续的有机农业系统，在农业活动中越来越重要，并在很多地区得到实践[5]。全国稻渔一体化共养殖面积超过200万 公顷，水产品产量超过290万 t[5]。在不同的共养模式中，水稻-鱼共养模式已有1200 a的历史[6]。水稻-克氏原螯虾共养模式是近年发展起来的共养模式[7]，被认为是一种高效的种植养殖生态模式，并被农业农村部作为养殖核心技术在全国推广应用。2021年，该模式的种养面积2100万 亩，占全国稻渔综合种养面积的52.95%[4]。水稻-克氏原螯虾共养模式产出的克氏原螯虾产量占全国克氏原螯虾总产量的70%以上[7]。混合养殖模式有多种优势，例如提高农业经济效益[8]、改善生态系统功能[9]、改善稻田土壤环境[9-10]、减少杂草和农作物害虫[11]、降低农药化肥使用量及抗性基因的产生机率[12]等。王曜等[3]研究发现养殖克氏原螯虾的游离氨基酸（free amino acids，FAA）总量大于野生克氏原螯虾。Liu Qiao等[13]在研究四川地区克氏原螯虾肠道微生物的功能时发现，与水稻共养的克氏原螯虾虾尾中的鲜味氨基酸含量高于池塘养殖的克氏原螯虾。除此之外，江苏兴化地区目前还存在多种克氏原螯虾的共养模式，如虾蟹共养、藕虾共养及水稻的一稻两虾和一稻一虾等，对多种共养模式影响克氏原螯虾的氨基酸品质的综合评价尚未报道，高品质克氏原螯虾的共养模式对克氏原螯虾品质影响的内在机制也有待研究。

主成分分析（principal component analysis，PCA）是一种通过正交变换将一组可能存在相关性的变量转换为一组线性不相关的变量，用简化的数据反映原始数据的多元统计分析方法[14]。PCA已被广泛用于食品品质的综合评价，范婷婷等[15]利用PCA对不同省份人工种植和野生羊肚菌的FAA进行分析，发现特征性FAA的含量高低直接影响羊肚菌的风味，区分效果较好。克氏原螯虾的品质中，滋味品质是决定克氏原螯虾被消费者喜爱程度的重要指标，而FAA是一类重要的味觉活性成分，是决定克氏原螯虾滋味的关键因子。每种FAA具有独特的滋味，如鲜味、甜味、苦味等，其含量会直接影响食物的鲜美程度[16]。甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、丝氨酸（Ser）、苏氨酸（Thr）等是甜味氨基酸[16-18]，其中Gly和Ala对蟹、虾等水产品的滋味有重要贡献[14-15]。鱼、虾、贝等水产动物中各种FAA含量丰富，谷氨酸（Glu）等鲜味氨基酸对水产动物的鲜美滋味有决定性作用[19]。精氨酸（Arg）是克氏原螯虾虾尾肉中含量最高的氨基酸，且呈味贡献也最大[3,13]。天然Arg呈苦味，但有助于食物呈愉悦的滋味而非苦味，有提高味道的丰富性和鲜度的作用[17]。克氏原螯虾虾头因含有肝胰脏、性腺等器官，其FAA的含量高于虾尾肉[3]。利用PCA法对克氏原螯虾中FAA的呈味氨基酸进行综合评价，有助于筛选出呈味氨基酸含量高的克氏原螯虾的养殖模式。FAA对克氏原螯虾的鲜美滋味有重要贡献，本研究拟通过对江苏兴化地区不同共养模式的克氏原螯虾肉中FAA的组成和含量及氨基酸的滋味活性值（taste active value，TAV）进行分析，并采用PCA法和聚类分析法进行综合评价，建立综合评价模型，以期为克氏原螯虾的特征风味研究、克氏原螯虾特征风味品质的养殖模式筛选提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

克氏原螯虾于2022年8月取样于江苏兴化。

样品信息：一稻两虾（RC1），兴化市万颗子粮食种植家庭农场；一稻两虾（RC2），兴化市香湖粮食种植家庭农场；一稻一虾（不开沟）（RC3），兴化市谷满仓家庭农场；虾蟹混养（CC1），兴化市七里八乡水产生态养殖专业合作社；虾蟹混养（CC2），兴化市银桂水产品养殖专业合作社；藕虾模式（LC），兴化市沙沟镇克氏原螯虾协会。

三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）、氢氧化钠国药集团化学试剂有限公司；氨基酸混合标准溶液、茚三酮显色液（色谱纯）日本Wako公司；纯净水娃哈哈集团；0.22 μm滤膜 美国Merck Millipore公司。

1.2 仪器与设备

L-8900氨基酸自动分析仪 日本Hitachi公司；5424R高速低温离心机 德国Eppendorf公司；T25高速匀浆机、Kylin-Bell Vortex-5涡旋混匀器 德国IKA公司；HI-9025酸度计 意大利Hanna公司；-40 ℃冰箱中国海尔集团；Alpha1-2LDplus实验室型冻干机 德国Chris公司；Scientz-IID超声波细胞粉碎机 中国宁波新芝公司；上海精宏DHG-9036A恒温干燥箱 中国光明公司；ME104E电子分析天平 瑞士Mettler-Toledo公司。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理

剥取出虾尾肉，进行真空冷冻干燥：将虾肉（5 只）放入平皿中，在-40 ℃冰箱中冷冻24 h，取出放置于冻干机中真空冷冻干燥48 h，取出后利用小型粉碎机粉碎成粉后保存于-40 ℃冰箱。称取0.05 g样品，加入5 mL TCA（0.1 g/mL），样品涡旋混匀，采用超声波处理15 min后，4 ℃静置2 h，4 ℃、10000×g离心10 min后取2 mL上清液，调pH值至2.0，最后用pH 2.0的TCA溶液定容至5.0 mL，经0.22 μm滤膜过滤后用氨基酸自动分析仪测定氨基酸含量。虾肉中水分含量采用GB 5009.3—2016《食品中水分的测定》直接干燥法，利用恒温干燥箱烘干称质量结果进行计算。

1.3.2 检测方法

使用L-8900氨基酸自动分析仪测定氨基酸，利用优化过的离子交换-茚三酮柱后衍生法：阳离子交换柱（4.6 mm×60 mm）；分离柱温度57 ℃，检测器温度135 ℃；流动相流速0.40 mL/min，茚三酮流速0.35 mL/min；进样量20 μL；检测波长：570 nm（17 种氨基酸），440 nm（脯氨酸）；结果用仪器自带软件EZChrom Elite分析。

1.3.3 TAV分析

TAV是呈味物质的测定值与其滋味阈值之比，TAV=C1/C2，其中，C1为呈味氨基酸的测定值/（mg/g）；C2为该氨基酸的滋味阈值/（mg/g）[20]。

1.3.4 PCA及综合评价

采用SPSS 18对数据进行因子分析，得到原始数据相关矩阵的特征值、方差贡献率、累计方差贡献率、成分矩阵等，根据所得信息对本研究的数据作综合评价，分析中提取特征值大于1.00的因子作为PC。以每个PC所对应特征值的方差贡献率λi（i=1，2，3，…，k）为权重数，由各PC得分Xi与对应的权重相乘得到最终的综合评价模型：PC=λ1X1+λ2X2+…+λkXk[14]。

1.3.5 聚类分析

采用OriginPro 2018C对各养殖模式的克氏原螯虾肉中FAA的测定结果作聚类分析（Ward最小方差和欧氏距离法）。

1.4 数据处理

通过单因素方差分析（SPSS Statistics 18）对数据作显著性分析，分析方法为Duncan多重范围检验，P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 不同养殖模式克氏原螯虾肉FAA的组成与含量

由表1可知，从各养殖模式的克氏原螯虾肉中共检测到17 种FAA。不同养殖模式的克氏原螯虾肉的FAA总含量在21.80～27.11 mg/g之间，其中养殖模式RC1的克氏原螯虾肉FAA含量最高（（27.11±1.03）mg/g），RC2、LC和CC2与其没有显著差异。Arg在所测6 组克氏原螯虾肉中均为含量占比最高的FAA，占总FAA的含量最高达67.76%（RC3），占比最低55.64%（RC2）。除含量占绝对优势的Arg外，苏氨酸（Thr）、丙氨酸（Ala）的含量在各养殖模式的克氏原螯虾肉中的含量居其次。其中，Thr在所测克氏原螯虾肉中的占比在5.09%～9.16%之间，Ala的含量在5.84%～11.81%之间。6 组克氏原螯虾肉中天冬氨酸（Asp）的含量均为最低，0.01～0.02 mg/g，仅占FAA总量的0.04%～0.09%。必需氨基酸在6 组克氏原螯虾肉中占比在7.12%～16.30%之间，其中养殖模式RC1的克氏原螯虾肉中必需氨基酸含量最高（（4.42±0.13）mg/g），占FAA总量的16.30%，RC2的克氏原螯虾肉中必需氨基酸含量与RC1无显著差异，CC2养殖模式的克氏原螯虾肉中必需氨基酸含量最低（（1.93±0.45）mg/g）。

表1 不同养殖模式克氏原螯虾肉中FAAs的组成与含量Table 1 Contents of free amino acids in meat of crayfish from different co-culture modes

2.2 滋味分析

由表1可知，RC2模式养殖的克氏原螯虾肉中Glu的含量为（0.35±0.08）mg/g，显著高于其他养殖模式的克氏原螯虾肉，而CC1养殖模式的克氏原螯虾肉中Glu含量最低（（0.12±0.03）mg/g）。RC2养殖模式的克氏原螯虾肉中甜味氨基酸（Thr、Ser、Gly、Ala）的含量也为最高（（7.67±2.62）mg/g），占FAA总量的28.58%，但是与RC1养殖模式的甜味氨基酸含量差异不显著。CC1养殖模式的甜味氨基酸含量最低（（3.82±0.17）mg/g）。Ser和Thr为甜味氨基酸[21]。

对不同养殖模式的克氏原螯虾肉FAA的TAV进行评价（表2），大部分氨基酸的TAV小于1，对克氏原螯虾肉的滋味无贡献。Arg的TAV最高，贡献最大。Arg是所有养殖模式的克氏原螯虾肉中占FAA总量比例最高的氨基酸。6 组克氏原螯虾肉中的甜味氨基酸Ala和苦味氨基酸His的TAV也都大于1。Glu作为鲜味最强的氨基酸，只在RC2模式的克氏原螯虾肉中TAV大于1。只有RC、RC2、CC2克氏原螯虾肉中的Gly的TAV大于1，分别为1.06、1.67、1.15，呈味作用差异显著。通过对FAA滋味的综合分析，发现养殖模式RC2的克氏原螯虾肉的鲜味和甜味氨基酸的TAV最高，味道最为鲜美。

表2 不同养殖模式的克氏原螯虾肉FAA的TAVTable 2 Taste activity values of free amino acids in meat of crayfish from different co-culture modes

2.3 相关性分析

在做PCA之前，需对数据进行适应性检验[14]。如表3所示，各氨基酸之间有正相关也有负相关，且大部分呈显著相关（P＜0.05），尤其是Glu与Ser，Gly与Ala，Pro与Thr、Lys、Val、Ile、Leu、His，Val与Thr、Asp、Pro，His与Thr、Ser、Pro、Lys、Val等之间相关系数在0.8以上，这表明克氏原螯虾肉中的FAA间相关性较强，可通过PCA对不同养殖模式克氏原螯虾肉中的FAA进行综合评价。

表3 FAA间相关性分析Table 3 Correlation analysis among free amino acids

2.4 不同养殖模式的克氏原螯虾肉FAA的PC差异

特征值代表某一项PC所反映原始变量信息的权重，由表4可知，经PCA所抽取的3 个PC特征值均大于1，累计方差贡献率为89.937%（累计方差贡献率大于85%即被认为能较好地反映原始信息）。选取前3 个PC，反映不同养殖模式克氏原螯虾肉FAA的大部分信息。由图1可知，6 组养殖模式的克氏原螯虾肉FAA的区分效果较好，所有数据点均位于95%置信区间内。

图1 不同养殖模式的克氏原螯虾肉FAA的PCA得分图Fig.1 PCA score plot of major free amino acids in meat of crayfish from different co-culture modes

表4 PC的特征值和贡献率Table 4 Eigenvalues of principal components and their contribution rates and cumulative contribution rates

如表5所示，特征向量代表各氨基酸在所提取3 个PC矩阵中的权重系数，载荷值表示原始变量对所取因子影响的大小，正负代表方向。3 个PC从不同方面反映不同养殖模式的克氏原螯虾肉FAA的综合品质，PC1方差贡献率为51.934%，主要代表Ser、Thr、Val、His、Leu、Ile、Cys、Glu、Gly、Pro、Tyr的信息。PC2方差贡献率为27.747%，主要代表Pro、Glu、Ala、Asp、Gly、Tyr、Phe、Met的变异信息。PC3方差贡献率为10.256%，其载荷绝对值最大的前2 位是Phe、Met。3 个PC基本上能代表所测氨基酸的大部分信息。

表5 PC的特征向量与载荷矩阵Table 5 Principal component eigenvectors and loading matrix

2.5 不同养殖模式的克氏原螯虾肉FAA的综合评价

由前述分析可知，利用经PCA提取的3 个因子（可以代表所有FAA信息的89.937%）对6 组养殖模式的克氏原螯虾肉中的FAA进行综合评价可行。将PC1、PC2、PC3作为3 个新变量替代原17 个指标，得到克氏原螯虾肉中FAA的前3 个PC线性关系分别为：

以每个P C 对应的方差相对贡献率作为权重，对3 个P C 得分进行权重加和，建立综合评价函数PC=0.519PC1+0.277PC2+0.103PC3，计算各组的综合得分，分数高低可反映不同养殖模式克氏原螯虾肉中FAA综合品质的高低。由表6可知，3 个PC综合得分最高的是RC2，其次是RC1，得分最低的是CC1，稻虾模式养殖的克氏原螯虾肉的FAA综合品质相对较好。

表6 不同养殖模式的克氏原螯虾肉FAA的成分得分和综合评价Table 6 Principal component scores and comprehensive assessment of free amino acids in meat of crayfish from different co-culture modes

2.6 聚类分析

对不同养殖模式的克氏原螯虾肉FAA的品质进行聚类分析，结果如图2所示，上方树状为不同组别的养殖模式聚类，左侧树状为FAA的聚类。从上方聚类看，6 组克氏原螯虾肉的FAA品质可分为3 类，第1类为RC2，品质最好，甜味氨基酸和鲜味氨基酸含量较高；第2类为RC1和LC，品质较好，甜味氨基酸中的Thr、Pro含量较高；第3类为CC1、CC2、RC3，品质较差，鲜味和甜味氨基酸含量较低，Met、Phe、Leu等苦味氨基酸含量较高。FAA的聚类可分为5 大类，Arg单独一类，含量较高且与其他氨基酸相关性较弱；Asp、Gly、Glu、Ala、Tyr聚为一类，是主要鲜味和甜味氨基酸；Met作为限制氨基酸单独一类；其余氨基酸主要为苦味氨基酸，分为2 类。聚类分析与PCA结果相近，可以较好体现不同养殖模式的克氏原螯虾肉的差异性。

图2 不同养殖模式的克氏原螯虾肉FAA的聚类分析热图Fig.2 Dendrogram from cluster analysis of free amino acids in meat of crayfish from different co-culture modes

3 讨论

从各养殖模式的克氏原螯虾肉中共检测到17 种FAA，王曜等[3]从野生和养殖克氏原螯虾肉中共检测到15 种FAA。与之相比，本研究检测出脯氨酸（Pro）和半胱氨酸（Cys）2 种氨基酸，这可能与FAA提取方法和检测灵敏度及养殖模式差异等有关。不同养殖模式的克氏原螯虾肉的FAA总含量在21.80～27.11 mg/g之间，该结果显著高于王曜等[3]在养殖克氏原螯虾肉中检测的总FAA的6.96 mg/g。Arg为含量占比最高的FAA，天冬氨酸（Asp）在6 组克氏原螯虾肉中的含量都为最低，结果与王曜[3]和Liu Qiao[13]等在养殖克氏原螯虾肉中检测到的Arg和Asp含量接近。此外，研究发现，Ala和Arg在FAA含量占绝对优势是甲壳类动物的重要特征[19-23]。

FAA是食品中的主要呈味物质之一，根据滋味特征，可将FAA分为鲜味氨基酸（Glu、Asp）、甜味氨基酸（Ala、Thr、Ser、Gly、Pro）、苦味氨基酸（Arg、Lys、Val、Tyre、Phe、Met、Ile、Leu、Cyst、Met、His）[16]。不同呈味FAA间的相互作用影响克氏原螯虾肉的鲜美滋味。养殖模式RC2的克氏原螯虾肉中有更高含量的鲜味氨基酸（Glu和Asp），占FAA总量的1.31%。在所有呈味氨基酸中，Glu呈鲜滋味最强[24]。此外，Glu是作用于大脑和外周组织的主要兴奋性神经递质，进入人体后，结合氨形成谷氨酰胺，减轻氨的毒性作用，因而能治疗肝昏迷，还能促进血液循环改善皮肤和毛发状况[25]。CC1养殖模式的甜味氨基酸含量最低（（3.82±0.17）mg/g）。Ser和Thr是甜味氨基酸[21]。Gly、Ala能使水产动物肌肉产生令人愉悦的甜味，例如河豚鱼、螃蟹等，其中Gly还能减弱食物中令人不悦的苦味[23,26]。

不同氨基酸的味觉感知阈值不同，含量高的氨基酸对滋味的贡献不一定大，因此需要进一步采用TAV对各氨基酸进行呈味贡献评价。TAV＞1时，该种呈味物质对于食物呈味有影响，数值越大贡献越大；TAV＜1时，表示该物质呈味贡献不大。Arg是所有养殖模式的克氏原螯虾肉中占FAA总量比例最高的氨基酸。Arg加入蔗糖、谷氨酸钠、NaCl、咖啡和柠檬酸等溶液中改善对各物质甜、鲜、咸、苦、酸的感知[27]。只有RC2模式的克氏原螯虾肉中Glu的TAV大于1，RC、RC2、CC2克氏原螯虾肉中的Gly的TAV大于1，呈味作用差异显著。通过对FAA滋味的综合分析，发现养殖模式RC2的克氏原螯虾肉的鲜味和甜味氨基酸的TAV最高，味道最为鲜美。不同的养殖模式中使用的饲料营养成分[28-30]、放养密度和形式[8]、形成的微生态系统[6]、饲养环境如水温、pH值、含氧量、微生物[19,23-24]、克氏原螯虾肠道微生物等的差异[13]，可能造成了克氏原螯虾肌肉中FAA的组成和含量的不同。

PCA可以将原始变量的大量指标信息用较少的变量（通常为5 个以内）反映出来[14]，已被广泛用于农产品品质评价。本实验利用PCA，从17 种氨基酸中提取得到3 个PC变量较好地反映了克氏原螯虾肉FAA品质的综合信息。各氨基酸与相应PC的相关性由载荷值表明，载荷值的绝对值越大，相关程度越高。表5结果表明，所提取的3 个PC变量基本上能代表所测氨基酸的大部分信息。利用3 个PC变量建立综合评价模型：PC=0.519PC1+0.277PC2+0.103PC3，通过该模型进行计算，得分越高反映不同养殖模式的克氏原螯虾肉中FAA品质越好。聚类分析利用确定的标准如欧氏距离或曼哈坦聚类计算样品之间的相关性，根据相关程度将各评价对象进行简化合并，可以更直观地综合比较评价对象[31]。PCA结合聚类分析可以简化品质评价工作[31]。聚类分析将6 组克氏原螯虾肉分为3 类，与PCA结果相近，RC2品质最好，CC1、CC2、RC3的品质较差，可以较好地体现不同养殖模式的克氏原螯虾肉的差异性。FAA品质的差异性受养殖的环境、生物模式、投放虾苗情况及饲喂情况等多种因素的影响，本研究结果可为地方特色克氏原螯虾养殖模式、氨基酸营养价值、滋味品质提升等提供一定参考依据。

4 结论

兴化地区不同养殖模式的克氏原螯虾肉中FAA的总含量在21.80～27.11 mg/g之间，其中养殖模式RC1的克氏原螯虾肉FAA含量最高（（27.11±1.03）mg/g）。Arg在6 组克氏原螯虾肉中均为含量最高的FAA，占总FAA的含量最高达67.76%（RC3），最低55.64%（RC2）。RC2养殖模式的克氏原螯虾肉中鲜味氨基酸和甜味氨基酸的含量最高，CC1养殖模式的鲜味和甜味氨基酸含量最低。大部分氨基酸的TAV小于1，对克氏原螯虾肉的风味无贡献。通过FAA的滋味综合分析发现养殖模式RC2克氏原螯虾肉的鲜味和甜味氨基酸TAV最高，味道最为鲜美。PCA建立的综合评价模型计算结果表明，RC2得分最高品质最好，CC1模式得分最低品质较差。聚类分析将6 组克氏原螯虾肉分为3 类，与PCA结果结合较好地体现了不同养殖模式克氏原螯虾肉的差异性。综上所述，在虾肉FAA的品质方面，稻虾模式（一稻二虾）养殖的克氏原螯虾肉品质相对较好，虾蟹混养模式较差。克氏原螯虾在我国养殖地域广泛，养殖模式众多，本研究为筛选适合养殖滋味鲜美的克氏原螯虾的模式提供一定的基础，为建立优质克氏原螯虾的养殖模式提供更全面的指导，需要结合克氏原螯虾肉的其他品质性质进行综合分析。