南方红豆杉鲜叶浸提液对3 种药用植物种子萌发与幼苗生长的化感作用

李文杨魏歌刘秀青魏岚岳建华

(信阳农林学院林学院/信阳市林木遗传育种重点实验室，河南信阳 464000)

植物化感作用在农业、旱生沙地、牧场和草原等农业生态系统中发挥着重要作用，作为一门新兴的交叉学科，目前已成为研究的热点。 Moral等[1]研究指出，短叶红豆杉(Taxus brevifolia)对3种植物的化感作用效应不同，表明植物间化感作用存在个体差异。 南方红豆杉(Taxus wallichianavar.mairei)全株含紫杉醇及其衍生物[2]，具有显著的发展潜力。 李春英等[3]研究发现，南方红豆杉枝和根浸提液对喜树(Camptotheca acuminataDecne.)种子具有化感作用。

近年来，中药材需求不断增加。 受我国耕地资源、种植条件限制，加上药用植物年龄增加和经济利益驱使而普遍出现的药用植物连作和生长不良现象，导致药材质量和产量显著下降，因此连作障碍已成为制约我国中药生产发展的重大问题[4-5]。 林药间作作为林地行间种植中药材的栽培模式，可充分利用森林资源发展林下经济，是农林复合经营模式中的一种，具有高效可行性[6-7]。但目前林药间作还处于探索研究阶段，还需要通过试验来确定合理的不同林药植物间作模式及其经济效益、生态效益表现。 关于南方红豆杉与农作物、草本植物、乔木之间的化感作用及其间套作也有待进一步深入研究。 本试验以3 种药用植物即黄芩(Scutellaria baicalensisGeorgi)、紫花苜蓿(Medicago sativaL.)、牛蒡(Arctium lappaL.)为受体，研究南方红豆杉鲜叶浸提液对其种子萌发和幼苗生长的化感作用，旨在了解林药植物之间的化感作用，探明南方红豆杉与3 种药用植物林药间作的可行性，为南方红豆杉间作套种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

浸提液供试材料选取:于2021年10月下旬在河南省信阳市信阳农林学院南方红豆杉大棚试验基地选择5年生南方红豆杉植株，采其带有新鲜嫩绿叶片的枝条。

受体材料:黄芩(Scutellaria baicalensisGeorgi)、紫花苜蓿(Medicago sativaL.)、牛蒡(Arctium lappaL.)3 种药用植物种子，2021年9月中下旬购于河北万草种业有限公司。

1.2 南方红豆杉浸提液的制备

将选取的南方红豆杉枝条带回实验室，用流水冲洗叶片，再用蒸馏水冲洗若干次，置于实验台晾干表面水分，之后将剪碎的叶片用粉碎机粉碎后备用。 称量100 g 南方红豆杉叶粉放入到1 000 mL 蒸馏水中浸泡48 h，之后用纱布过滤得到100 g·L-1纯浓度母液，-4 ℃冷藏。 用蒸馏水将南方红豆杉叶浸提液分别稀释成2、6、10 g·L-1三种不同浓度。

1.3 种子萌发试验

参照田胜尼等[7]和李怡莹[8]的方法进行。按种子质量指标分别选取黄芩、紫花苜蓿和牛蒡种子，均用1% KMnO4溶液消毒30 min，再用无菌水冲洗干净，置于培养皿中培养。 不同处理培养皿分别加入2、6、10 g·L-1南方红豆杉叶浸提液2 mL，对照(CK)加相同体积的蒸馏水。 每个培养皿放置种子40 粒，每处理重复3 次。 将培养皿置于恒温培养箱中进行种子萌发试验，温度控制在(25±1) ℃，光照强度为2 000 lx，光照14 h/黑暗10 h。 每天观察种子发芽情况，3 天补充1 次相同浓度的浸提液。 黄芩和牛蒡种子在萌发第5 天、紫花苜蓿种子在第4 天计算初次发芽率，在萌发第10—14 天计算末次发芽率，统计各处理种子每天的发芽指数并计算平均值。

发芽率(GR)＝(正常发芽种子数/供试种子数)×100%；

发芽指数(GI)＝∑Gt/Dt，式中Gt 为第t 天种子发芽数，Dt 为相应的发芽天数。

1.4 幼苗生长试验

种子萌发试验结束后，将已发芽种子从培养皿中移栽到带浮漂板的水培育苗盘(育苗盘规格为:长32.5 cm、宽24.5 cm、高12 cm，用种植棉固定植株于外孔径35 mm、内径23.5 mm 的定植篮后再放入孔径为32 mm 的浮漂板上)中，用7 天营养液(史丹利水培型植物营养液:营养液∶水＝1∶200 mL)与7 天蒸馏水交替培养，蒸馏水与营养液中分别加入不同处理浓度浸提液，培养条件同1.3 步骤，30 天时采样测定苗高、根长和生理生化指标。

1.5 生理生化指标测定

每个处理随机选取12 株幼苗为试材，混合采样后立即用液氮冷冻，-80 ℃下贮藏。 采用乙醇提取比色法[9]测定光合色素含量，采用硫代巴比妥酸法[10]测定丙二醛(MDA)含量，采用WST-1法[11]测定超氧化物歧化酶(SOD)活性，采用可见分光光度法[12]测定过氧化物酶(POD)活性，采用紫外分光光度法[13]测定过氧化氢酶(CAT)活性。

1.6 数据统计与分析

采用Microsoft Excel 2019 进行数据处理和作图，用SPSS 19.0 软件对数据进行单因素方差分析(One-way ANOVA)和差异显著性检验。 参照Williamson[14]、邹子湘[15]等的方法，采用化感效应指数(RI)进行化感效应分析，公式为:

式中，C 为CK 值，T 为处理值。

化感效应的强弱＝｜RI ｜，与CK 相比，正值表示促进(RI＞0)，负值表示抑制(RI＜0)，化感综合效应指数(SE)是各项RI 的平均值。

2 结果与分析

2.1 南方红豆杉浸提液对3 种药用植物种子萌发与幼苗生长的影响

南方红豆杉浸提液对3 种药用植物种子萌发的影响作用不同(表1)。 其中，2 g·L-1浸提液显著抑制黄芩和牛蒡的发芽率，对紫花苜蓿的发芽率影响不显著；10 g·L-1浸提液显著降低紫花苜蓿的发芽率，对黄芩和牛蒡的发芽率影响不显著。 10 g·L-1浸提液浓度下黄芩、紫花苜蓿和牛蒡的发芽指数最高，比CK 分别上升3.10%、0.93%和3.71%。

10 g·L-1南方红豆杉浸提液显著促进黄芩、紫花苜蓿和牛蒡的幼苗生长，苗高比CK 分别增加26.15%、42.23%和109.02%(P＜0.05)，根长比CK 分别增加111.18%、39.53%和48.33%(P＜0.05)。 不同浓度浸提液对黄芩根长均呈显著促进趋势，其中6 g·L-1浸提液促进作用最低。 紫花苜蓿苗高和根长分别在2、6 g·L-1浸提液浓度下达到抑制最大值，与CK 相比，分别下降18.94%、32.05%(P＜0.05)。 对牛蒡苗高和根长的抑制作用均在2 g·L-1浸提液浓度下最大，且差异显著。

2.2 南方红豆杉浸提液对3 种药用植物光合色素含量的影响

由表2 可以看出，南方红豆杉浸提液浓度为10 g·L-1时，黄芩的叶绿素a、类胡萝卜素含量和叶绿素总含量最高，呈促进作用，与CK 相比分别增加26.09%、16.67%和25.00%，其中叶绿素a 和叶绿素总含量差异显著。 在2 ～10 g·L-1浸提液浓度下紫花苜蓿的叶绿素a、类胡萝卜素含量和叶绿素总含量随浓度增加而降低，表现为抑制作用；10 g·L-1浸提液浓度下紫花苜蓿叶绿素a 和类胡萝卜素含量比CK 分别下降51.72%和66.67%(P＜0.05)；2 g·L-1浸提液对紫花苜蓿叶绿素b 含量有促进作用，比CK 增加8 倍(P＜0.05)。 南方红豆杉浸提液对牛蒡的叶绿素a、类胡萝卜素含量和叶绿素总含量具有“低浓度促进高浓度抑制”的作用，6 g·L-1浸提液对牛蒡的光合色素含量促进作用最强；10 g·L-1浸提液抑制作用最大，其叶绿素a、类胡萝卜素含量和叶绿素总含量与CK 相比分别下降29.41%、50.00%和13.04%。

2.3 南方红豆杉浸提液对3 种药用植物丙二醛(MDA)含量和保护酶活性的影响

2.3.1 对丙二醛(MDA)含量的影响由图1 可知，2 g·L-1浸提液处理黄芩和紫花苜蓿的MDA含量最高，比CK 分别增加19.43%和141.05%，且紫花苜蓿达到显著水平；6 g·L-1浸提液处理黄芩和紫花苜蓿的MDA 含量最低，与CK 相比分别下降45.12%和10.14%。 6 g·L-1浸提液处理牛蒡的MDA 含量最高，与CK 相比增加87.71%(P＜0.05)；2 g·L-1浓度处理的MDA 含量最低，与CK相比下降15.20%。

图1 南方红豆杉浸提液对3 种药用植物丙二醛含量及保护酶活性的影响

2.3.2 对过氧化物酶(POD)活性的影响6 g·L-1浸提液处理牛蒡的POD 活性最高，与CK 相比升高164.00% (P＜0.05)。 各浓度处理间相比6 g·L-1浸提液处理紫花苜蓿的POD 活性最高；2 g·L-1浸提液处理黄芩的POD 活性最高，而该浓度下紫花苜蓿的POD 活性最低，两者比相应CK分别下降34.67%和38.94%(P＜0.05)。 10 g·L-1浸提液处理牛蒡的POD 活性最低，但比CK 仍升高26.00%，达显著水平(图1)。

2.3.3 对过氧化氢酶(CAT)活性的影响10 g·L-1浸提液处理黄芩的CAT 活性最高，与CK 相比升高345.46%(P＜0.05)；2 g·L-1浸提液处理的CAT活性最低，与CK 相比也显著升高227.26%。2 g·L-1浸提液处理紫花苜蓿和牛蒡的CAT 活性最高，比相应CK 分别升高163.64%、227.27%(P＜0.05)；10 g·L-1浸提液处理的CAT 活性最低，但较CK 也分别升高36.36%、63.64%(P＜0.05)。

2.3.4 对超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响2 g·L-1浸提液处理黄芩的SOD 活性最低，比CK下降12.69%；10 g·L-1浸提液处理的SOD 活性最高，比CK 上升8.38%。 10 g·L-1浸提液处理紫花苜蓿的SOD 活性最低，与CK 相比降低23.54%(P＜0.05)；6 g·L-1浸提液处理的SOD 活性最高，与CK 相比差异不显著。 10 g·L-1浸提液处理牛蒡的SOD 活性最低，比CK 下降37.59%(P＜0.05)；2 g·L-1浸提液处理牛蒡的SOD 活性最高，与CK 相比显著上升11.21%。

2.4 南方红豆杉浸提液对3 种药用植物化感综合效应指数(SE)的影响

由表3 可以看出，南方红豆杉浸提液各浓度处理下黄芩发芽率的化感效应指数(RI)均为负值，呈抑制趋势；根长的RI 均为正值，呈促进趋势；叶绿素总含量的RI 值说明，随着浸提液浓度增加呈现低浓度抑制高浓度促进的趋势，即2 g·L-1浓度下叶绿素总含量的RI 值最小，抑制作用最强。 黄芩CAT 活性的RI 均为正值，呈促进作用，而POD 活性的RI 则与其相反，呈抑制作用。 在2～10 g·L-1浸提液浓度之间黄芩的化感综合效应指数(SE)值分别为0.060、0.007 和0.098，呈现“V”型变化趋势。

表3 南方红豆杉浸提液对3 种药用植物化感综合效应指数(SE)的影响

不同浓度南方红豆杉浸提液处理下紫花苜蓿种子萌发指标的RI 多为负值，呈抑制趋势；苗高的RI 值说明，其作用为“低抑高促”；根长的RI在10 g·L-1浓度下值最大，为0.283。 2 g·L-1浸提液浓度下紫花苜蓿MDA 含量、CAT 活性的RI 值最大，分别为0.585 和0.621。 在2～10 g·L-1浸提液浓度之间紫花苜蓿的化感综合效应指数(SE)值为低浓度增大高浓度减小，2 g·L-1浸提液处理下SE 值为0.007，呈促进趋势。

10 g·L-1南方红豆杉浸提液处理下牛蒡发芽率和发芽指数的RI 为正值，呈现促进作用；苗高和根长的RI 随着浸提液浓度增加而增大，呈现促进趋势，即在10 g·L-1浓度下RI 值最大，分别为0.522 和0.326。 牛蒡叶绿素总含量的RI 值说明，随着浸提液浓度增加呈现低浓度促进高浓度抑制的趋势。 牛蒡POD、CAT 活性的RI 分别在6 g·L-1和2 g·L-1浓度下达到最大值，分别为0.621 和0.649。6 g·L-1浸提液处理下牛蒡的SE 值最大，为0.242，具促进作用。

3 讨论

植物化感作用广泛存在于生态系统中，通过对其研究能合理地解释生态系统中植物种群分布、群落演替、协同进化和生物入侵等现象[16]。而在化感作用性质当中，化感自毒作用严重影响着农林业的发展。 药用植物目前普遍存在化感自毒现象，通过向周围和同种间释放化学物质来影响它们的正常生长[17]。 本研究中，南方红豆杉浸提液对黄芩与牛蒡的化感综合效应均为正值，表现为促进作用；而对紫花苜蓿的化感综合效应值呈现高浓度抑制趋势，这与猪毛蒿(Artemisia scoparia)浸提液[18]和大狼毒(Euphorbia jolkinii)浸提液[19]对紫花苜蓿种子萌发影响的相关研究结果一致，即随浸提液浓度增加化感抑制作用增强。板栗(Castanea mollissima)叶水浸提液对黄芩种子发芽率的化感作用呈现“低促高抑”，其中20 g·L-1浸提液促进作用最显著，40 g·L-1浸提液显著抑制其发芽[20]。 本试验中，黄芩能较好地适应2～10 g·L-1南方红豆杉浸提液，10 g·L-1浸提液化感综合效应值最大。 这说明此浸提液浓度范围均促进黄芩生长，下一步研究可以在此基础上进一步扩大浸提液浓度范围，探索最适黄芩生长的南方红豆杉浸提液浓度。 人参(Panax ginsengC. A.Meyer)根系分泌物水对牛蒡种子萌发呈现“中低浓度促进高浓度抑制”，其中10 μg·mL-1处理促进作用最显著[21]。 而本研究发现，6 g·L-1浸提液对牛蒡的化感综合效应值最大，促进作用最强，说明受体牛蒡对不同植物的化感适应性不同。 综合以上南方红豆杉浸提液对3 种药用植物化感综合效应的研究发现，南方红豆杉适宜与黄芩、牛蒡间作栽培，不适宜与紫花苜蓿间作栽培，与牛蒡间作要注意控制行间距、保持低密度种植。

关于不同浓度南方红豆杉浸提液对受体植物光合色素含量的影响，本研究发现，6 g·L-1浸提液对受体牛蒡光合色素含量促进作用最显著，10 g·L-1浸提液提高受体黄芩光合色素含量的作用最显著。 受体植物化感综合效应值最大的处理其叶绿素含量也最高。 不同浓度浸提液均抑制紫花苜蓿叶绿素含量，且随浸提液浓度增高化感抑制作用越强，这与光叶紫花苕子(Vicia villosa)地上部和地下部浸提液均抑制紫花苜蓿种子萌发的研究[22]结果一致。 这也说明植物叶绿素含量是反映植物营养胁迫、光合作用和生长状况的重要指标，对研究植物生理特性和抗性具有重要意义[23]。

植物受到逆境胁迫时会发生膜脂过氧化，以最终产物丙二醛含量来反映植物在逆境下的受损程度。 CAT、SOD、POD 普遍存在于植物组织中，是植物抗氧化系统中的主要酶，通过防止膜脂过氧化来抑制高浓度氧的积累，维持植物的正常生长发育，有效延缓植物衰老[24]。 从本试验结果来看，黄芩保护酶CAT、SOD 活性随着南方红豆杉浸提液浓度增高而逐渐增加，POD 活性的变化趋势则相反，10 g·L-1浸提液下黄芩POD 活性最低；10 g·L-1和6 g·L-1浸提液下黄芩MDA 含量较低，两者之间差异不显著，与CK 相比显著降低。 这与10 g·L-1核桃(Juglans regiaL.)叶水浸液提高黄芩幼苗SOD、 CAT 活性且降低MDA 含量的结果较一致[25]。 本研究结果显示，6 g·L-1浸提液下牛蒡MDA 含量和POD 活性最高，其CAT 活性与CK 相比显著增加，SOD 活性有所增加但与CK 差异不显著。 戴敏等[26]发现，高浓度Pb 胁迫下牛蒡MDA 含量最大时仍然具有较高的发芽率和保护酶活性，这说明牛蒡的抗氧化系统抵御逆境伤害能力较强。 植物体内存在着许多感受不同逆境信号的受体，参与各种逆境胁迫响应，并形成一个复杂的响应和调控网络以应对逆境胁迫[27]。 抗氧化酶活性的调节能力是临时和有限的[28]。 受到胁迫时，植物会诱导体内抗氧化能力的增强，这种适应性的反应只能够在一定受害程度内发挥作用，当体内氧化产物累积到一定水平时各种酶不能正常发挥作用导致酶活性下降，但不同植物的自身抗氧化酶活性的调节能力和耐受程度不同，受体植物所感受到的化感物质对自身的胁迫程度也不同，从而呈现不同的化感作用。

4 结论

南方红豆杉浸提液对3 种药用植物的化感作用强度不同，并且3 种药用植物所呈现出的化感效应也不同，其对黄芩与牛蒡的化感综合效应均为正值，其中6 g·L-1浓度对牛蒡的化感综合效应作用最显著。 不同浓度南方红豆杉浸提液会引发紫花苜蓿、黄芩、牛蒡种子萌发和生长过程中体内保护酶和膜脂过氧化产物等物质的变化。 受体植物和化感物质浓度的不同会使其生理代谢物质呈现出不同的化感现象。