二陈汤通过调控脾脏铁转运能力改善非酒精性脂肪性肝病小鼠的铁代谢

邓广辉，贾慧，李允家，李俊杰，吴潮锋，石皓，秦梦晨，赵嘉敏，刘畅，廖雨欣，高磊

1南方医科大学中医药学院，广东 广州 510515；2南方医科大学中西医结合医院消化内科，广东 广州510315

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是以脂质代谢紊乱为主要特征的一种代谢性疾病。在NAFLD的进展中，肝脏会发生一系列典型的组织病理学变化，从单纯的脂肪性变到伴有或不伴有纤维化的脂肪性肝炎，并最终发展为肝硬化或肝癌［1,2］。近年来，其发病率逐年上升，成年人发病率达20%～33%，已成为我国第1大慢性肝病［3,4］。目前针对脂肪性肝病的治疗药物虽然有很多，但因其副作用多或疗效有限，无法适用于所有人群，迄今为止还没有药物获得美国食品及药物管理局批准用于NAFLD［5］。目前的研究表明，部分肥胖者机体内不仅存在脂代谢紊乱的现象，还伴随铁离子异常累积的表现。这提示脂质代谢紊乱与铁代谢紊乱密切相关［6］。已有研究［7］证明铁过载会加剧NAFLD中的肝损伤程度，而减少铁的摄入量可以有效缓解脂肪性肝病的进一步恶化。而过量的铁离子通过芬顿反应生成大量的活性氧自由基（ROS），后者直接导致细胞DNA、脂质和蛋白质的损伤［8］。我们前期的研究也证实高脂饮食可诱导小鼠铁离子代谢紊乱，加剧肝组织内铁离子累积，而抑制铁离子累积可部分缓解NAFLD的进展［9］。

二陈汤由半夏、陈皮、茯苓、甘草、乌梅、生姜组成，具有燥湿化痰、理气和中功效。《古今名医方论》：“二陈为治痰之妙剂，其于上下左右无所不宜”。临床统计发现，二陈汤加减治疗组总有效率为87%，高于对照组67%的有效率［10］。基础研究表明二陈汤通过抑制脂质累积和炎症反应，可有效缓解大鼠NAFLD的进展［11,12］。研究表明NAFLD 患者证型以肝郁脾虚证型最为普遍，占比32.3%，发病原因与主要症状均与脾脏密切相关［13］。然而，从铁稳态的角度探讨二陈汤调控脾脏功能缓解NAFLD的研究仍旧缺乏。

综上所述，结合传统中医和现代医学对于脾脏功能的理解和认识［14,15］，我们试图从脾脏调控铁离子代谢的角度探讨二陈汤防治NAFLD的作用机制。因此，本研究采用高脂饮食诱导小鼠NAFLD模型，以多烯磷脂酰胆碱为阳性对照药［16］，以不同剂量二陈汤为干预手段，深入探究二陈汤通过改善脾脏铁稳态调控NALFD进展的作用机制，为中药防治疾病提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 野生型C57BL/6J 小鼠36只，6～8 周龄，SPF级，体质量20±2 g，购于广东省医学实验动物中心。动物合格证号：44007200 065781；许可证号：SCXK（粤）2018-0002。饲养温度23～25 ℃，相对湿度50%～65%；每天更换垫料，给予充足饲料。该动物实验方案由南方医科大学实验动物伦理委员会批准（伦理编号：L2020044）。

1.1.2 药物及试剂 模型组饲料：高脂饲料，饲料代码：TP 26305（热量：4.5 kcal/g，热量组成：脂肪42%，蛋白质14%，碳水化合物44%。胆固醇含量0.2%）；对照组饲料：低脂低糖饲料，饲料代码：TP26362。均购买于南通特洛菲饲料科技有限公司。二陈汤（半夏15 g、橘红15 g、茯苓9 g、炙甘草4.5 g、乌梅3 g、生姜3.5 g）的药材均购买于安徽同化堂中药饮片科技有限公司，经南方医科大学中医药学院邵萌副研究员鉴定，均符合2020年版《中国药典》规定。多烯磷脂酰胆碱（PPC，易善复，赛诺菲北京制药有限公司，批准文号：国药准字H20059010，9.12 mg/kg）作为阳性对照药物，将其溶解于蒸馏水中备用。

抗体：铁转运蛋白（Fpn1，NOVUS），前列腺六跨膜上皮抗原3（Steap3，Abcam），转铁蛋白受体（TfR，Abcam），血红素加氧酶1（HO-1，Abcam），GAPDH（CST），CD68（Abcam），CD163（proteintech），Ter-119（ThermoFisher），铁蛋白轻链（proteintech），辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（CST），辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG（CST）。RIPA裂解缓冲液（上海碧云天生物技术有限公司），ECL 蛋白质印迹检测试剂（MA），尼罗红粉末（Sigma），DAPI（索莱宝生物科技有限公司），免疫组化试剂盒（上海基因科技有限公司），铁离子检测试剂盒（Abcam），普鲁士蓝染色试剂盒（贝博）。单体：野漆树苷（曼思特），柚皮素（曼思特），甘草酸（曼思特），甘草查尔酮A（曼思特）。

1.1.3 仪器与设备 全波长酶标检测仪（Thermo Fisher Scientific），低温高速离心机（5427R，Eppendorf），台式高速大容量离心机（5810R，Eppendorf），RM2245石蜡切片机、EG1160包埋机、CM-1850冰冻切片机（徕卡公司），病理显微镜Eclipse E100、激光共聚焦显微镜C2（尼康公司），正置激光共聚焦显微镜（LSM 880，蔡司），KZ-Ⅱ高速组织研磨仪（Servicebio），曝光仪（北京赛智创业科技有限公司），Chemray 240和Chemray 800全自动生化分析仪（深圳雷杜生命科技），高效液相色谱仪（UltiMate3000，ThermoFisher赛默飞）。

1.2 方法

1.2.1 药物制备 中药煎煮方法参考《中药药理实验方法学》（上海科学技术出版社，2006 年版），将药物按照比例混合放于陶制中药锅内，加适量去离子水浸泡30 min，开始煎煮直至水沸腾，文火慢煮30～40 min。收集剩余药液，倒入500 mL烧杯中。重新加水于锅中进行二次煎煮。将两次煎出药液混合后，置95～98 ℃水浴锅中加热浓缩，并制备成相应浓度的水煎剂。

1.2.2 分组给药和模型制备 参考本人既往发表文章采用的NAFLD 小鼠模型构建方法［9］，36 只雄性野生型C57BL/6J 小鼠适应性喂养1周，随机分为对照组（Control）、模型组（Model）、二陈汤低剂量组（ECDL）、二陈汤中剂量组（ECDM）、二陈汤高剂量组（ECDH），多烯磷脂酰胆碱组（PPC），6只/组。对照组喂养低脂饲料（饲料代码：TP26362），其余组则喂养高脂饲料（饲料代码：TP 26305），所有小鼠均采用自由饮食模式进食。于第12周末结束造模。所有小鼠均自由饮水进食。

药物组小鼠在高脂饮食第7周开始灌胃给药，二陈汤低剂量组、中剂量组和高剂量组生药给药量分别为7.5、15、30 g/kg，多烯磷脂酰胆碱组为9.12 mg/kg。其中低剂量组，由临床常用剂量生药质量/体质量，按照人鼠比例进行换算；其余各组灌胃等量饮用水。各组均按1 mL/100 g小鼠体质量进行灌胃，3次/周，持续给药6周，隔天观察小鼠毛发、饮食、自主活动及精神状态等情况，每周记录小鼠体质量1次。

1.2.3 标本采集 用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠，完成采血后使用灌注仪进行心脏灌注，然后采集肝脏和脾脏，部分放置于4%多聚甲醛中浸泡，剩余部分的肝脏和脾脏组织分装到1.5 mL EP管中，放置-80 ℃冰箱保存以备后用。小鼠全血在室温静置2～4 h后，放置常温离心机离心（3000 r/min，离心15min），离心结束后分离上清，放置于-80 ℃冰箱中保存。

1.2.4 肝组织病理学检测及分析 4%多聚甲醛溶液固定的肝组织和脾组织常规处理固定，脱水、石蜡包埋，切成4 μm厚切片，根据标准流程进行脱蜡和水化。此外部分固定的组织用OCT胶包埋，切成14 μm厚的切片。采用相应的切片进行HE和尼罗红染色，光镜下观察肝脏脂肪变性情况。

1.2.5 HPLC-MS分析法 采用高效液相色谱法对二陈汤水煎剂的活性成分进行鉴定分析。取500 μL药液，加入500 μL乙醇，18 000×g离心5 min，离心后留取上清。另取500 μL药液称重，用500 μL超纯水提取，再次18 000×g离心5 min，离心后留取上清。取500 μL两上清混合液，用0.22 μm过滤器过滤混合液，制备原液，最后对样品进行分析。基于HPLC分析结果，从二陈汤样品中鉴定出的4个单体组成分别与标准混合物中的相应峰匹配。

1.2.6 普鲁士蓝染色法 切片脱蜡至水后，蒸馏水洗3遍，2 min/次。滴加适量的试剂A溶液，孵育15～30 min；孵育结束后蒸馏水洗3遍，3 min/次。然后往切片上滴加适量核固红试剂B溶液染细胞核8 min。自来水流冲洗直至水变干净。脱水封片，正置显微镜下观察拍照。

1.2.7 免疫蛋白印迹法 将适量的肝、脾组织剪碎后加入组织裂解液（含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液），匀浆机匀浆，4 ℃，12 000×g离心15 min，收集上清液。用BCA法测定蛋白质浓度。制好蛋白样后进行电泳并转膜。5%BSA封闭后，孵育一抗Fpn1（兔，1∶1000）、Steap3（兔，1∶1000）、HO-1（兔，1∶1000）、TfR（兔，1∶1000）、GAPDH（兔，1∶1000），4 ℃过夜。用TBST洗涤3次，10 min/次，二抗室温孵育1 h。最后，多功能成像系统检测。通过Image J进行定量。

1.2.8 免疫组织化学法 切片脱蜡至水后，用枸橼酸钠溶液进行组织抗原修复，PBS洗3遍，3 min/次。加入3%过氧化氢溶液清除组织的内源性过氧化物酶，室温孵育10 min。PBS洗3遍，3 min/次。免疫组化封闭液室温孵育1～2 h。加入一抗溶液，4 ℃孵育12～16 h。PBS洗3遍，5 min/次。二抗溶液室温孵育1 h。PBS洗3遍，3 min/次。根据剂盒的说明书使用DAB溶液进行显色反应。滴加苏木精染料染细胞核，3 min/张。脱水封片，放置通风橱中静置晾干，正置显微镜中观察拍照。

1.2.9 免疫荧光染色法 冰冻切片用PBS洗2次，10 min/次。通透液通透10 min后，PBS洗3 min；加适量封闭液，室温封闭1 h。滴加适量一抗溶液，4 ℃孵育12 h。次日PBS洗3遍，10 min/次。室温下孵育二抗溶液1 h。PBS 洗2遍，10 min/次。使用DAPI 溶液孵育5min，PBST洗2遍，5 min/次。抗荧光淬灭剂封片后，在荧光显微镜下观察拍照。

1.2.10 铁离子浓度检测 采用全自动生化分析仪（深圳雷都生命科技：Chemray 240或Chemray 800）检测血清铁离子浓度。操作方法参既往发表的文章［9］。

1.2.11 统计学方法 采用GraphPad Prism8.0软件作图和SPSS22.0软件分析数据，计量资料以均数±标准差表示，两组样本比较采用两独立样本t检验；多组样本间比较采用单因素方差分析，若方差齐性，采用Turkey检验方法进行组间两两比较；若方差不齐，则采用Dunnett's T3检验方法进行组间比较。P＜0.05时认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 二陈汤活性成分的鉴定

对比标准品混合物溶液图谱（图1A）与二陈汤样品图谱（图1B），柚皮素的保留时间分别为10.08 s 和10.07 s，相应保留时间处m/z 分别是271.06085、271.06088；甘草酸的保留时间分别为12.25 s和12.26 s，相应保留时间处m/z分别是821.39484、821.39471；野漆树苷的保留时间分别为7.60 s 和7.65 s，相应保留时间处m/z 分别是577.15558、577.15662；甘草查尔酮A的保留时间分别为13.62 s 和13.63 s，相应保留时间处m/z分别是337.14401、337.14374。

2.2 二陈汤有效改善NAFLD小鼠模型的脂代谢紊乱

图2A显示模型构建和给药处理的时间节点，从第7周开始灌胃给药，在第12周末结束造模。首先观察小鼠肝脏的整体形态变化，对照组肝脏形态正常，颜色呈红褐色。模型组肝脏表面光滑有脂滴，颜色呈橘黄色。二陈汤中剂量组和高剂量组可明显改善肝脏的病变，而多烯磷脂酰胆碱降脂效果比二陈汤的降脂效果差（图2B）。HE染色和尼罗红染色结果表明，与模型组相比，中剂量组和高剂量组二陈汤可有效缓解肝脏的脂质累积，而低剂量二陈汤和多烯磷脂酰胆碱减轻肝脏脂质累积的效果明显较差（图2C、D）。

图2 二陈汤抑制高脂饮食诱导的脂代谢紊乱Fig. 2 Erchen Decoction inhibits lipid metabolism disorder induced by high-fat diet. A: Flow chart of NAFLD mouse model establishment and drug intervention.B:Overall lesion map of mouse liver.C:HE staining results of the liver tissue in each group.D:Nile Red staining of the liver tissue in each group.ECDL:Erchen Decoction low-dose group;ECDM:Erchen decoction mediumdose group;ECDH:Erchen decoction high-dose group;PPC:Polyene phosphatidyl choline group.

2.3 高脂饮食通过抑制TfR表达抑制脾脏细胞的铁摄入能力

普鲁士蓝染色结果表明，高脂饮食引起脾脏红髓的铁含量显著降低（图3A）。免疫蛋白印迹方法发现与对照组比较，模型组小鼠脾脏组织的TfR蛋白表达显著下调（P＜0.01，图3B），免疫组织化学染色方法结果也证实高脂饮食抑制脾脏TfR蛋白的表达（P＜0.05，图3C）。

图3 高脂饮食降低脾脏细胞的铁离子摄入能力Fig. 3 High-fat diet reduces iron uptake capacity of the spleen cells.A:Prussian blue staining for observing iron content in the spleen.B:Expression of TfR protein in the spleen detected by Western blotting.C: Expression of TfR protein in the spleen detected by immunohistochemistry.*P＜0.05,**P＜0.01 vs Control group.

2.4 高脂饮食通过上调Fpn1表达促进脾脏细胞的铁排出能力

免疫蛋白印迹结果分析显示，与对照组相比，模型组小鼠脾脏组织Fpn1和Steap3蛋白表达显著上调（P＜0.05，图4A）。免疫组织化学染色方法分析显示，高脂饮食促进脾脏Fpn1蛋白表达（P＜0.01，图4B）。免疫荧光染色方法分析再次证实，与对照组相比，模型组脾脏Fpn1蛋白表达上调（P＜0.05，图4C）。

2.5 二陈汤改善脾脏细胞的铁离子转运能力

与对照组比较，模型组血清铁含量显著增多（P＜0.01），而二陈汤和多烯磷脂酰胆碱均可有效降低血清铁离子浓度（P＜0.01，图5A）。普鲁士蓝染色结果显示，二陈汤和多烯磷脂酰胆碱可上调NAFLD模型中脾脏红髓的铁含量（图5B）。免疫组织化学法检测脾脏TfR、Fpn1和Steap3蛋白的表达水平。与对照组相比，模型组脾组织TfR蛋白表达显著下调（P＜0.001）。与模型组相比，中剂量二陈汤、高剂量二陈汤以及多烯磷脂酰胆碱上调脾组织TfR蛋白的表达（P＜0.05，图5C）。与对照组相比，模型组脾组织Fpn1蛋白表达明显上调（P＜0.01）。与模型组相比，中剂量和高剂量二陈汤均可下调脾组织Fpn1蛋白的表达（P＜0.01，图5D）。与对照组相比，模型组脾组织的Steap3蛋白表达显著上调（P＜0.05）。与模型组相比，中剂量二陈汤组和多烯磷脂酰胆碱组Steap3蛋白的表达较模型组下调（P＜0.05，图5E）。

图5 二陈汤调控脾脏细胞的铁离子转运能力Fig. 5 Erchen Decoction regulates iron transport in the spleen cells.A:Serum iron level in each group.B:Prussian blue staining of the spleen tissue in each group.C:Expression of TfR protein in the spleen detected by immunohistochemistry.D:Expression of Fnp1 protein in the spleen detected by immunohistochemistry. E: Expression of Steap3 protein in the spleen detected by immunohistochemistry.*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001 vs Control group.#P＜0.05,##P＜0.01,###P＜0.001 vs Model group.

2.6 二陈汤改善脾脏巨噬细胞降解红细胞的能力

接着检测脾脏中Ter-119蛋白表达的情况以及不同表型巨噬细胞的数量。模型组小鼠脾组织Ter-119蛋白表达水平与对照组无显著性差异（图6A）。与对照组相比，模型组脾组织CD68和CD163蛋白的表达显著增多（P＜0.05，图6B）。与模型组比较，中剂量二陈汤和多烯磷脂酰胆碱均未改变CD163 和CD68 蛋白的表达（图6B）。有趣的是，与对照组比较，模型组小鼠HO-1蛋白表达降低（P＜0.01，图6C），而二陈汤中剂量组和多烯磷脂酰胆碱组小鼠脾组织HO-1蛋白表达较模型组上调（P＜0.05，图6C）。

图6 二陈汤调控脾脏巨噬细胞降解红细胞的能力Fig. 6 Erchen Decoction regulates the ability of splenic macrophages to degrade red blood cells.A:Expression of Ter-119 protein in the spleen detected by immunohistochemistry.B:Expressions of CD163 and CD68 proteins detected by immunofluorescence assay.C:Expression of HO-1 protein in the spleen detected by immunoblotting.*P＜0.05,**P＜0.01 vs Control group.#P＜0.05,##P＜0.01 vs Model group.

3 讨论

目前的研究表明NAFLD是一种复杂的代谢性疾病，而脂质代谢紊乱是引起NAFLD发生发展的关键。随着研究的深入，研究者发现脂质累积所诱发的其它变量可能是NAFLD进展的关键，并且提出“多次打击”的学说［17］：脂代谢紊乱引起的铁过载［18］、炎症细胞激活、氧化应激、肠道菌群失调、脂肪组织功能障碍、线粒体功能障碍等引起的细胞损伤和死亡，是决定NAFLD进展的关键。这表明NAFLD的发生发展存在多种潜在的干预因素，仍需进一步探讨。目前主流的治疗方案主要是从维护体内脂质代谢和抗氧化平衡等角度出发，常选用辛伐他汀等降脂类药物、吡格列酮等胰岛素增敏剂、维生素E等抗氧化剂以及多烯磷脂酰胆碱［19-21］。虽然上述部分药物已经在临床上被应用，并在一定程度上缓解NAFLD患者的病情，但是这些药物由于副作用多或疗效有限，无法适用于所有人群［22］。而中医药具有改善胰岛素抵抗，降低肝脏脂质沉积和减轻肝脏炎症的显著作用，对本病的治疗有其独特优势，并且可极大程度的减弱毒副作用［23,24］。为此，从中医药宝库深入挖掘防治NAFLD的中药和治疗方案，具有重大的临床意义。

二陈汤最早见于《太平惠民和剂局方》，被誉为“千年祛痰方”。后世各医家根据“异病同治”的理论，将该方随证化裁，应用于一系列由“痰湿”之邪所诱发的疾病，比如代谢性疾病、呼吸系统疾病、心血管疾病等。现代研究［25-28］发现，二陈汤具有良好的化痰、降血脂的药理作用，可以从降低脂质累积和减轻氧化应激损伤等角度改善NAFLD的进展。为了解二陈汤的可能药理机制，经HPLC-MS分析，我们发现二陈汤的活性成分包含柚皮素、野漆树苷、甘草酸和甘草查尔酮A。其中柚皮素、野漆树苷及甘草查尔酮A均为黄酮类化合物，具有护肝解毒和抗氧化等作用。研究表明柚皮素可有效降低机体内TC和TG的生成和累积，亦具有良好的抗炎作用［29,30］；野漆树苷具有抗过氧化、清除自由基、抗炎的作用［31,32］；甘草酸具有抗炎、降脂、抗氧化等多种生化与药理特性，亦可以抑制高糖诱导的炎症反应和氧化应激损伤［33］；甘草查尔酮A可以通过Nrf2介导的防御机制起到良好的护肝作用［34］。本研究选用高脂饮食诱导的NAFLD小鼠经典模型，成模率高，稳定性好。研究结果显示，高脂饮食3个月成功诱导小鼠肝脏发生明显的脂质累积。经多烯磷脂酰胆碱和二陈汤干预后，小鼠的脂质代谢状态均得到部分改善，与既往研究结果相符［25,35］，但是二陈汤的降脂效果较多烯磷脂酰胆碱显著。上述结果表明二陈汤对NAFLD中脂质代谢具有良好的调节作用。

铁离子是有机生物维持正常过程所需的重要元素，通过参与氧气运输、线粒体呼吸、物质代谢和细胞信号传导等维持机体的正常生理功能。而铁代谢失调将会导致一系列疾病的发生，包含贫血、NAFLD、心血管疾病、肿瘤等多种疾病［36］。在部分肥胖者中，脂代谢紊乱与铁过载往往并存。我们前期的研究表明，高脂饮食可加剧小鼠铁离子代谢紊乱，并上调血清铁离子和肝组织铁离子浓度［9］。所以调控铁稳态可能是防治NAFLD发生发展的关键。另外，有研究表明，除了肝脏、小肠和骨髓，脾脏也是铁离子代谢的关键靶器官，与机体铁稳态密切相关［37,38］。因此，为了进一步揭示NAFLD小鼠体内铁代谢紊乱的可能调控机制，本研究重点探讨脾脏功能改变对铁离子代谢的影响和可能存在的作用机制。我们采用普鲁士蓝染色方法证实高脂饮食显著降低脾脏铁离子的含量。上述结果表明，高脂饮食不仅诱导肝脏铁代谢紊乱，还加剧脾脏铁稳态失调。研究表明与Tf结合的三价铁离子，通过与肝细胞膜上的TfR蛋白结合，促进细胞铁离子的吸收［39］。进入胞内的三价铁离子通过铁还原酶Steap3将三价铁还原为二价铁。Fpn1，作为一种跨膜的铁输出蛋白，是铁离子释放的唯一出口，负责将细胞内的二价铁离子排出胞外［40,41］。我们的研究表明，高脂饮食通过抑制TfR蛋白表达减少脾脏细胞铁离子的摄入。上调的Steap3可以促进三价铁转换成二价铁，然后通过Fpn1蛋白将脾脏细胞铁离子排出，进而降低脾脏铁离子含量，最终导致NAFLD铁代谢紊乱。目前大部分的研究主要从脂代谢紊乱方向探讨二陈汤防治NAFLD的效果。结合前面所述，脂代谢紊乱所诱发的“二次打击”才是NAFLD 进一步恶化的关键。为此，我们试图从另外的角度探讨二陈汤防治NAFLD的作用机制。中医理论认为脾主运化水液和水谷精微以化生气血，与现代医学中脾脏代谢铁离子的生理功能不谋而合。结合中药“多靶点、多层面”的优势，我们猜测二陈汤可能通过调控脾脏铁稳态缓解NAFLD的进展。此外，我们已经证实化橘红可有效降低高脂饮食诱导的铁离子代谢紊乱［9］。如预期那样，二陈汤可以有效逆转上述结果，而多烯磷脂酰胆碱与二陈汤相比，改善铁离子代谢的能力无显著性差异。因此，二陈汤通过改善脾脏细胞转运铁离子的能力以维持NAFLD铁稳态。

现代研究表明饮食和红细胞降解释放是铁离子的主要来源［42,43］。人体每天需要20～25 mg的铁离子以维持正常的生理功能，但饮食来源的铁离子只有1～2 mg/d［35］。因此红细胞来源的铁离子是维持机体铁稳态的重要来源。而脾脏红髓的巨噬细胞是降解衰老和损伤红细胞的重要细胞。CD163+巨噬细胞是一类重要的噬红细胞，可通过血红素加氧酶(HO-1)降解血红素以回收再利用铁离子［44］。因此，我们通过Ter-119标记红细胞，免疫组织化学染色结果显示高脂饮食并没有改变脾脏红细胞的数量。与对照组相比，模型组CD163+巨噬细胞数量虽然显著升高，但模型组脾脏铁离子含量却明显降低（普鲁士蓝染色结果），似乎两者相互矛盾。此外，二陈汤未能显著改变CD163+巨噬细胞的数量。有趣的是，与对照组相比，高脂饮食显著降低脾脏细胞HO-1蛋白的表达。而二陈汤和多烯磷脂酰胆碱可上调HO-1的表达。综上所述，二陈汤通过上调CD163+巨噬细胞HO-1蛋白的表达影响该类噬红细胞的功能，以改善机体铁稳态。

综上，本研究证实二陈汤不仅可以改善NAFLD脂代谢紊乱，而且可以通过调控脾脏细胞铁离子转运能力和脾脏巨噬细胞降解红细胞能力改善NAFLD铁代谢紊乱，为临床治疗NAFLD提供新的切入点和方向。然而，二陈汤作为中药复方，具有多靶点、多层面干预的优势和特色，本研究仍存在一些局限性。其对于NAFLD脾脏细胞铁离子转运能力相关靶标蛋白的调控仍需相应的基因调控小鼠进一步深入探讨。此外，后续将依据HPLC-MS分析的结果，进一步明确二陈汤中活性成分干预NAFLD进展的具体作用机制。